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转基因棉花MON757转化体特异性PCR检测方法及应用 总被引：3，自引：0，他引：3
转基因棉花(Gossypium hirsutum)MON757转化体是孟山都公司研发的转cryIAc基因的抗虫棉,在美国、加拿大、澳大利亚等国被批准种植或允许用作食品饲料原料,但在我国尚未获得批准种植和应用.目前国内外尚没有转基因棉花MON757特异性的纯杂合检测和定量检测方法报道.为了检测我国棉花中MON757转化体的存在情况,本研究以转基因棉花MON757转化体的插入位点基因组序列和外源插入片段/基因组连接区序列为靶标,建立了特异性的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测方法.所建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法的检测引物由分别位于MON757外源基因插入位点两侧基因组和外源插入片段上的3条引物组成,能准确地鉴别棉花植株和种子中MON757转化体的纯合、杂合状态.建立的MON757转化体特异性的qRT-PCR检测方法具有良好的可重复性和灵敏度,其检测下限(limit of detection,LOD)为11个拷贝,定量下限(limit of quantitative,LOQ)为44个拷贝.用此方法对2014年湖北省的49份商品棉花种子进行了检测,结果有5份种子样品检测到MON757转化体.采用MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法对这5份种子样品各60个单粒分别进行了检测,同时采用qRT-PCR检测方法对这5份种子样品进行定量测定.结果表明,有1份含量在1.5％左右,4份含量超过了20％,两种方法的测定结果基本一致.本研究建立的MON757转化体纯杂合定性PCR检测方法和qRT-PCR检测方法在田间棉花植株和种子中MON757转化体纯杂合状态的测定以及混合样品中MON757转化体含量的测定方面都具有重要的应用价值. 相似文献
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转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化 总被引：2，自引：0，他引：2
转基因玉米(Zea mays)MON88017是美国孟山都公司通过DNA重组技术开发的具有抗玉米根叶甲虫(Diabrotica virgifera)和抗草甘膦类除草剂特性的玉米品系,本研究的目的是建立该品系的转化事件特异性定性检测方法的标准.根据转基因玉米MON88017的旁侧序列信息,在左边界的结合位点处设计一系列引物组合,在筛选出最佳引物组合后,优化了该引物组合的反应体系,建立了转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法.全国7家实验室的验证结果表明,该方法能够特异性检测样品中MON88017转化事件,检测灵敏度均达到0.10%以上,且检测结果具有良好的可重复性、可重现性.本方法符合标准检测特异性强、灵敏度高、重复性好的要求,为我国抗虫耐除草剂玉米MON88017检测和转基因生物安全管理制度的实施提供了相应的技术支撑. 相似文献
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转基因高赖氨酸玉米LY038在畜禽饲料中已得到广泛应用,但目前还没有关于其侧翼序列扩增及转化事件特异性定性PCR检测方法方面的报道.本研究采用修饰接头连接PCR(modified adapter-linked PCR,M-AL-PCR)技术获得了转基因玉米LY038的外源基因与玉米基因组之间的5′端侧翼序列.据此侧翼 序列设计其转化事件特异性引物,建立了转基因玉米LY038转化事件特异性定性检测方法,扩增片段175bp.以转基因玉米(Zea mays L.)LY038、MIR604、Bt176、Bt11、MON810、MON863、GA21、NK603、非转基因玉米、转基因水稻(Oryza sativa L.)Cry1C*、Cry2A*、转基因大豆(Glycine max)Roundup Ready和转基因油菜(Brassica campestris L.)GT73为材料,验证该方法具有高特异性及灵敏度,最低检测限约为0.1%.研究结果提示,该定性检测体系可准确、快速、高效的检测转基因玉米LY038及其产品. 相似文献
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利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数 总被引：8，自引：0，他引：8
微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一种基于泊松分布原理的核酸分子绝对定量技术,在核酸分子的绝对计数/定量领域具有极大的应用潜力。本研究基于ddPCR平台,以转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19和转人乳铁蛋白基因基因山羊(Capra hircus)134为例,建立了转基因生物(genetically modified organisms,GMOs)外源基因拷贝数分析方法,并比较了其与传统的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Southern blot方法的准确性。实验数据表明,T1c-19的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein,Cry1C*)在qRT-PCR和ddPCR测定结果比较一致,约为2拷贝,但已报道的Southern blot分析结果为1拷贝;ddPCR对bar基因的分析结果高于qRT-PCR,分别为2.09拷贝和1.51拷贝。转人乳铁蛋白基因(human lactoferrin,HLF)山羊134在qRT-PCR和ddPCR的分析结果基本一致,均测得含有1拷贝的HLF基因。研究结果表明,微滴数字PCR方法是一种经济、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,灵敏度和准确性高,将会在拷贝数分析中广泛应用。 相似文献
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实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测转基因成分的数据分析及其标准化研究 总被引：1，自引：0，他引：1
在利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)检测转基因成分的含量时,数据分析的规范化与标准化对保证实验数据的准确性及实验室间数据的可比性具有重要意义。本研究以转基因玉米(Zea mays)NK603为研究材料,分析了分别以q RT-PCR中3次平行反应的单个Ct值和3次平行反应Ct值的平均值所绘制标准曲线的差异;分析了分别以盲样3次平行反应的Ct平均值和3次平行反应的拷贝数平均值(算术平均值或几何平均值)计算转基因成分含量的差异;并研究了结果准确性判定的方法。结果表明,标准曲线应基于单个Ct值;在计算转基因成分的含量时,Ct值应取算术平均值,拷贝数应取几何平均值;最后通过比较样品的测量结果与标准值之间的差异是否显著(UΔ>Δm,表明测量结果的平均值与样品的标准值无显著差别)来判断实验结果的可靠性。本研究为转基因产品检测中q RT-PCR实验数据处理的标准化提供了参考资料。 相似文献
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转植酸酶基因(phyA2)玉米定性、定量PCR检测 总被引：1，自引：0，他引：1
转植酸酶基因玉米检测是对转植酸酶基因玉米释放进行有效监管的重要前提和技术支撑。本研究根据转植酸酶基因玉米(Zeamays)外源植酸酶基因phyA2序列设计基因特异性引物,进行了定性、定量PCR检测。定性结果显示,该引物可有效检测植酸酶玉米中phyA2基因,而在其他不含植酸酶基因的材料中则检测不到相应基因,表明该引物具有很高的特异性。以玉米内标准基因玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2基因(zSSIIb)和植酸酶基因phyA2为对象,进行SYBRGreenⅠ染料法荧光定量PCR反应,绘制2种基因扩增循环数-拷贝数标准曲线图,根据混合样品中(zSSIIb)和植酸酶基因phyA2的拷贝数计算样品中的转基因含量,并做熔解曲线分析。结果表明,zSSIIb和phyA2标准曲线相关系数分别为0.998和0.995,相关性较好,两个基因的熔解曲线均呈单峰型,表明引物特异性较强,混合玉米样品(植酸酶玉米含量分别为1%、0.5%和0.1%)中植酸酶玉米含量分别为1.1%、0.54%和0.17%,实测值与理论值接近。本研究建立了转植酸酶基因玉米定性、定量PCR检测体系,可有效地对转植酸酶基因玉米进行检测。 相似文献
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用复合PCR方法检测6种转基因玉米中外源DNA的特异性 总被引：12，自引：0，他引：12
利用本实验室研制的植物DNA提取试剂盒，从玉米（Zea mays）种子中提取符合PCR检测要求的DNA。根据不同转基因玉米中重组DNA的结构，分别设计引物，可对Btl1、Event176、T25、MON810、GA21和NK603等6种转基因玉米进行特异性PCR检测。在此基础上建立了针对6种转基因玉米的特异性DNA片段和玉米内参照基因（zein）的复合PCR检测方法，能同时对7对引物进行扩增，通过产物的长度差异对不同的转基因玉米进行辨别，实现了在同一个PCR反应管中同时对6种不同转基因玉米的特异性检测。 相似文献
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转基因产品成分检测是转基因生物安全管理和标识的重要支撑,而转基因生物标准物质是获得准确、可靠、具有可比性检测结果的保证.转基因大豆(Glycine max) MON89788为我国批准进口用作加工原料的农业转基因生物,因此,制备转基因大豆MON89788基体标准物质是对其进行安全管理所必需的.本研究通过将转基因大豆MON89788和其受体材料A3244分别冷冻研磨成粉末,按质量分数称量配制,得到转基因含量为49.3 g/kg的标准物质.采用方差分析法(F检验法)进行均匀性检验,统计量F值为1.618,小于临界值F(0.05,11,24)标准物质均匀性良好;短期稳定性考察结果表明,标准物质可在常温下稳定储存4周,在-20℃下长期稳定性达到30个月.本批MON89788基体标准物质有两个特性量值,一是基于重量法配比混合的粉末质量分数,量值为49.3 g/kg,扩展不确定度为2.0 g/kg;二是基于qRT-PCR 8家实验室联合定值的转基因DNA与总DNA的质量分数,量值为49.8 ng/μg,扩展不确定度为5.9 ng/μg.本批标准物质每瓶1.0 g,使用时最小取样量为100mg,可用于对转基因大豆MON89788进行定性和定量检测,以及转基因大豆MON89788特异性检测方法的评价和实验室质量控制.本研究为我国转基因检测基体标准物质的研制提供了理论基础和技术支持. 相似文献
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转基因棉花GHB119品系特异性定量PCR检测方法的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
为了保障和促进我国口岸进口转基因产品安全相关法律法规的顺利实施,针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的棉花品系GHB119,本研究利用TaqMan实时荧光PCR(Real-time PCR)技术,根据转基因棉花(Gossypium sp.)GHB119 3'端外源插入片段与棉花基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,并对引物、探针以及扩增体系进行了筛选和优化,建立了转基因棉花GHB119品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法特异于转基因棉花GHB119成分检测,检测下限(limit of detection,LOD)为10拷贝的基因组DNA,定量下限(limit of quantification,LOQ)为25拷贝GHB119基因组DNA,对盲样的定量结果显示,测定值与设定值间的偏差(bias)、标准偏差(standard deviation,SD)、相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)等均在可接受范围内。本研究建立的GHB119品系特异性实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确地对混合样品中转基因棉花GHB119成分进行定量检测分析。 相似文献
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为获得进口转基因玉米筛查检测策略,并根据策略建立多重PCR方法,对15个进口转基因玉米分子特征进行分析。结果表明,将P-Ca MV 35S、T-NOS等2个基因组合作为检测策略可全部检出15个进口转基因玉米至少1次;将P-Ca MV 35S、P-ract1、T-NOS、bar、pat、PMI等6个基因组合作为检测策略,除MON810检出1次外,其他每个转化体可检出至少2次。同时,利用获得的筛查检测策略建立多重PCR体系,对2个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol·L-1)配比为0.2∶0.2;对6个基因组合的策略优化,结果表明适宜退火温度为60℃,引物终浓度配比为0.2∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.05。采用已知样品对多重PCR体系进行验证,图谱显示与转化体分子特征完全一致。该研究结果将为进口转基因玉米筛查检测提供参考。 相似文献
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本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
本文建立了敏感、特异的胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。以1型胸膜肺炎放线杆菌ApxIV基因片段为靶序列设计了一组引物,并建立了LAMP反应体系,在63℃等温条件下反应45min,最低能检测到102个拷贝的目的基因,敏感性是PCR方法的10倍。通过对1～10型胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、支原体等18种病原微生物的检测,证明该法具有很强的种特异性。另外,通过对8头实验感染猪和127份临床发病猪的鼻拭子的检测发现,该法对鼻拭子中胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%,优于PCR方法。 相似文献
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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)传统诊断方法具有程序繁琐、周期长、成本高、特异性差等缺点,本实验建立了敏感、特异的PRV的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并在此基础上应用金属离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)进行反应结果判定.实验选取保守性较高的gB基因(glycoprotein B,糖蛋白gB)筛选引物,确定反应体系后,可在45 min内完成检测.LAMP方法特异性与PCR方法一致,敏感性是PCR方法的100倍,最低能够检测10个拷贝的目的基因.在HNB的应用试验中,发现LAMP反应体系中,HNB浓度为150 μmol/L时,阴阳性的颜色对比明显且反应的敏感性最高,可用于LAMP扩增产物的判断.临床样本的检测结果表明,PCR方法和LAMP方法的检出率一致.因此,本研究中所建立的LAMP方法是一种高度特异敏感的,可替代PCR方法的检测技术. 相似文献
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牛支原体(Mycoplasma bovis是感染牛的一种重要的致病性病原体.本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法.该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5条特异引物,在58℃等温条件下,60 min即可完成反应.LAMP方法能检测出20 pg牛支原体DNA,较PCR方法高100倍,用牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测,两种方法均有很高的特异性.本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测.临床鼻拭子样品煮沸后,可直接进行等温扩增,省去了DNA提取步骤.在对167个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果阳性率(26.95％)高于PCR方法检测出阳性率(19.16％),这证明本研究所建立的方法,与PCR法比较更适于临床样品的检测.研究结果表明,LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点,适于基层实验室监测的广泛使用. 相似文献
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甜高粱蔗糖合成酶基因（Susy2）的克隆及结构和功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究以甘蔗蔗糖合成酶基因(susy2)cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索,将获得的4条与甘蔗相似性很高的EST序列进行拼接,后经基因组PCR、分子克隆和序列分析验证获得了甜高粱(sorghum bicofor)蔗糖合成酶基因DNA序列(Susy2,GenBank登录号为FJ513325).该序列全长4587 bp,起始密码子至终止密码子序列长4350 bp,包含一个2409 bp的开放读码框.该序列包含15个外显子和14个内含子,剪接方式都为GU/AG模式.Susy2编码的蛋白由802个氨基酸组成,分子量大小为91.7 kD,等电点pI为6.15.保守结构域分析表明,此蛋白含有一个475个氨基酸的GTI糖基化酶保守结构域(275～759),有4个ADP结合位点,能催化6-磷酸果糖和UDPG形成6-磷酸蔗糖. 相似文献
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基因芯片(gene chip)是依据核酸杂交原理发展的一种生物新技术,在生命科学研究领域具有重要的应用价值.本研究将不对称PCR和基因芯片两种技术相结合,构建了同步检测鸡(Gallus gallus)传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的共检基因芯片.分别选取ILTV的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)和糖蛋白B(glycoproteins B,gB)基因、NDV的融合蛋白(fusion,F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(haemagglutinin-neuraminidase,HN)基因以及IBV的膜蛋白(membrane,M)和核衣壳(nucleocapsid,N)基因设计引物,从重组质粒菌中扩增制备探针基因,用乙醇沉淀法纯化后点制于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;靶基因用cy3标记引物,进行不对称PCR扩增,扩增的荧光标记单链产物与芯片杂交.不对称PCR结果显示,当限制性引物与非限制性引物浓度比例在1:10时ILTV-TK、NDV-HN和IBV-N的单链产物增加最多,当浓度比在1:20时,ILTV-gB、NDV-F和IBV-M的单链产物增加最多;相应的标记样品与3种病毒检测芯片杂交后,均出现较强的杂交信号,而阴性对照检测不到荧光信号,灵敏性实验表明,当DNA浓度为1.8x 104拷贝时杂交仍为阳性.本研究构建的诊断基因芯片对12份临床样品进行初步应用检测,与PCR检测技术检出率基本一致.本实验所建立的联合检测基因芯片能够快速、准确、高通量的诊断NDV-IBV-ILTV,可以应用于集约化养殖业中对多种鸡疫病病毒的检测. 相似文献
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Understanding the mechanisms of Cu pollution-induced community tolerance (PICT) in soil requires the characterization of Cu-resistant microorganisms at a community level using modern molecular tools. A primer pair (copAF2010 (5 -TGCAC CTGAC VGGSC AYAT-3 )/copAR2333 (5 -GVACT TCRCG GAACA TRCC-3 )) tentatively targeting Pseudomonas-like Cu-resistant microorganisms was designed in this study. The specification of the primers was tested through conventional polymerase chain reaction (PCR) and the construction of a Pseudomonas-like copA gene fragment library, and then the primers were used to quantify the Cu-resistant microorganisms using quantitative PCR technique. A significant increase of Cu-resistant microorganisms targeted by the primers was observed in a paddy soil from Jiaxing, China which has been exposed to one-year Cu contamination. The results provided direct evidence for Cu PICT in the soil, and the quantification method developed in this study has the potential to be used as a molecular assay for soil Cu pollution. 相似文献
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利用PCR-DGGE技术研究长期自然恢复、种植作物和裸地条件下黑土土壤细菌群落结构变化 总被引：3，自引：0，他引：3
Soil microbial biomass and community structures are commonly used as indicators for soil quality and fertility. A investigation was performed to study the effects of long-term natural restoration, cropping, and bare fallow managements on the soil microbial biomass and bacterial community structures in depths of 0--10, 20--30, and 40--50 cm in a black soil (Mollisol). Microbial biomass was estimated from chloroform fumigation-extraction, and bacterial community structures were determined by analysis of 16S rDNA using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE). Experimental results showed that microbial biomass significantly declined with soil depth in the managements of restoration and cropping, but not in the bare fallow. DGGE profiles indicated that the band number in top 0--10 cm soils was less than that in depth of 20--30 or 40--50 cm. These suggested that the microbial population was high but the bacterial community structure was simple in the topsoil. Cluster and principle component analysis based on DGGE banding patterns showed that the bacterial community structure was affected by soil depth more primarily than by managements, and the succession of bacterial community as increase of soil depth has a similar tendency in the three managements. Fourteen predominating DGGE bands were excised and sequenced, in which 6 bands were identified as the taxa of Verrucomicrobia, 2 bands as Actinobacteria, 2 bands as α-Proteobacteria, and the other 4 bands as δ-Proteobacteria, Acidobacteria, Nitrospira, and unclassified bacteria. In addition, the sequences of 11 DGGE bands were closely related to uncultured bacteria. Thus, the bacterial community structure in black soil was stable, and the predominating bacterial groups were uncultured. 相似文献