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马铃薯Y病毒单克隆抗体的制备及其检测应用 总被引：1，自引：0，他引：1
《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2016,(5)
马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害农作物的重要病毒之一,在全球广泛传播并造成了严重的经济损失,而建立特异、灵敏的检测技术是防控PVY的关键。本研究以提纯PVYN病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得4株能分泌PVY单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3B2、3E4、20B2和25C2),杂交瘤细胞分泌的腹水单抗的效价在10~(-6)~10~(-7)之间,Western blot分析发现3B2、3E4和20B2这3株单抗仅与感染PVY的叶片中1条分子质量约为30ku的蛋白有特异性反应。该蛋白的分子质量与PVY的外壳蛋白亚基大小相符,推测制备的这3个单抗能识别PVY的外壳蛋白亚基,而25C2单抗与感染PVY的病叶组织中约55ku的蛋白有特异性反应。进而以制备的单抗为核心建立了检测植株中PVY的ACP-ELISA、dot-ELISA、tissue blot-ELISA和IC-RTPCR这4种血清学方法。特异性分析结果表明,这4种血清学方法检测感染PVY的样品呈阳性反应,而检测健康的烟草和马铃薯及感染马铃薯S病毒、马铃薯X病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯A病毒的样品呈阴性反应;灵敏度分析结果表明,ACP-ELISA和dot-ELISA检测马铃薯病叶的灵敏度分别达1∶81 920倍和1∶10 240倍稀释(g/mL),而具有最高检测灵敏度的IC-RT-PCR方法在感病植物组织稀释到1∶5 242 880倍(g/mL)时仍能检测到病毒。用建立的血清学方法对2015年采自云南的30个田间马铃薯样品进行检测,结果发现其中有20样品感染PVY,且血清学方法的检测结果与RT-PCR结果一致。抗PVY特异、灵敏单抗的制备及血清学检测方法的建立,为我国作物上PVY的检测和诊断、脱毒种薯生产、抗病育种和科学防控提供了物质和技术支撑。 相似文献
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黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科作物上重要的病毒之一.用提纯的黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫新西兰大白兔制备CGMMV的多克隆抗体.该多克隆抗体的间接ELISA效价达1∶512 000,与CGMMV17.5 ku外壳蛋白有特异性反应,而与烟草花叶病毒、齿兰环斑病毒和健康植物没有任何反应.用ACP-ELISA分析多抗灵敏度表明多抗检测1∶40 960倍稀释的CGMMV病叶时仍呈阳性反应.用该多抗建立了检测CGMMV的免疫斑点法(dot-ELISA)和免疫捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR).病叶汁液可被dot-ELISA检出的最大稀释度为1∶10 240.IC-RT-PCR从感染CGMMV的病叶组织中扩增到与预期大小相同的480 bp DNA条带,且当CGMMV病叶稀释1∶163 840倍时检测仍呈阳性.检测CGMMV的dot-ELISA和IC-RT-PCR方法的建立为该病毒病的诊断和控制提供了技术支撑. 相似文献
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地高辛标记探针检测5种葫芦科作物病毒的斑点杂交方法 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】探索5种葫芦科作物病毒即小西葫芦黄花叶病毒（Zuccini yellow mosaic virus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、番木瓜环斑病毒西瓜株系(Papaya ringspot virus watermelon strain，PRSV-W)和南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus，SqMV)的斑点杂交检测技术，为葫芦科作物种子带毒的快速准确鉴定、流行病学研究和转基因检测等提供技术和方法。【方法】以构建的重组质粒为模板，用PCR方法合成了相应的地高辛标记的cDNA探针。通过斑点杂交检测西葫芦病叶汁液来考察探针的灵敏性和特异性。同时设计了3种不同长度的SqMV探针（0.55、1.6、2.7 kb）对杂交效果进行了研究。【结果】ZYMV、WMV、CMV、PRSV-W和SqMV的5种探针检测各自侵染西葫芦病汁液的稀释低限分别为1﹕160、1﹕160、1﹕320、1﹕160、1﹕320，而每种探针与健康西葫芦和其它4种病毒的反应均为阴性。不同长度的SqMV探针杂交结果相同。【结论】用PCR方法合成的地高辛标记的探针，能够直接在植物组织中将5种病毒检测出来，具有较好的灵敏性、特异性和重复性。探针的长度对杂交的灵敏性和特异性没有影响。 相似文献
4.
【目的】明确甘肃省河西地区瓜类作物病毒病害的主要病毒病原,为当地瓜类作物病毒病的防治提供参考。【方法】自甘肃省河西地区采集有病毒病症状的瓜类作物新叶或果实共37份,利用双抗体夹心酶联免疫吸附分析(DAS-ELISA)方法对样本进行检测,并采用RT-PCR、CP基因片段测序、序列比对等方法对DAS-ELISA检测呈阳性的代表性样本进行复检。【结果】在37份瓜类作物病毒病样品中,有30份感染了西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV-W)和南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV),感染WMV、CMV、ZYMV、PRSV-W和SqMV的样品分别占样品总数的40.5%,32.4%,21.6%,21.6%和8.1%,其中27%的样品受2种以上病毒的复合侵染。【结论】该地区瓜类病毒病主要病原为WMV、CMV、ZYMV和PRSV-W,自然条件下常发生复合侵染。 相似文献
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【研究目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的快速鉴定检测是控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。【方法】通过汁液摩擦接种、透射电镜观察、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)和RT-PCR方法对该病毒进行鉴定;同时对RT-PCR反应体系及扩增程序进行优化,建立CGMMV免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)检测方法。【结果】血清学、生物学、电镜观察和分子生物学方法证明供试样本为黄瓜绿斑驳花叶病毒引致。IC-RT-PCR方法可以简化RNA的提取,降低对试验材料要求。【结论】IC-RT-PCR的建立为CGMMV的检测提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测方法。 相似文献
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小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备及ACP-ELISA检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立简便、有效、低成本小麦黄花叶病毒(WYMV)的检测方法,用提纯的WYMV免疫BALB/c小鼠后,利用杂交瘤细胞技术经细胞融合、筛选和克隆,共获得2D4、2D3和6F4 3株能稳定传代并分泌抗WYMV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并分别注射小鼠腹腔制备其单抗腹水。3株单抗腹水的间接ELISA效价为10~(-6)~10~(-7),抗体类型及亚类均为IgG1、κ链。特异性检测结果表明6F4和2D4这2株单抗仅与WYMV的32 kD外壳蛋白有特异性免疫反应。利用效价最高的2D4单抗建立了检测WYMV的抗原包被ELISA方法(ACP-ELISA),其灵敏度分析结果表明,当病叶以1∶25 600(g/ml)倍稀释时仍能检测到病毒,特异性分析结果表明可有效区分小麦易感染的中国小麦花叶病毒(CWMV)。田间样品检测结果表明该方法可准确、可靠地用于小麦WYMV的大规模检测。 相似文献
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用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗PVX单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞2B12和4E7,并分别制备它们的单抗腹水.2株单克隆抗体腹水间接ELISA效价在10-6以上,2B12和4E7的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链.利用这些单克隆抗体建立了抗原包被的间接ELISA(ACP-ELISA)检测PVX的方法.病叶经1:600倍稀释、提纯PVX病毒浓度为2 ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.2 ng)时,该方法仍能检测到病毒.利用ACP-ELISA方法测定了田间样品,发现PVX在马铃薯上发病很普遍. 相似文献
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【目的】调查和鉴定海南省辣椒和樱桃番茄病毒病发生情况和病毒种类,明确病毒病发生为害程度及毒源种类。【方法】2018—2019年,通过5点取样法对海南省10个市县的辣椒和樱桃番茄进行病毒症状类型、发病率和病情指数统计。采集辣椒和樱桃番茄主产区病毒病样本593份,通过斑点酶联免疫吸附法(dot-ELISA)对黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)和黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)5种病毒进行检测。【结果】辣椒病毒病主要症状是斑驳花叶和矮缩丛枝,发病率在0～75%之间,病情指数在0～25.67之间。樱桃番茄主要症状是皱缩卷曲和斑驳花叶,发病率在7%～98%之间,病情指数在1.67～37.33之间。辣椒病毒总体检出率为37.5%,复合侵染率为2.08%,樱桃番茄病毒总体检出率为20.33%,复合侵染率为0.98%。【结论】病毒病在辣椒和樱桃番茄上普遍发生,研究结果明确了辣椒和樱桃番茄田间发病状况,dot-ELISA检测结果表明CMV和TMV仍是检测的5种病毒中的优势毒源,存在4种类型的复合侵染。 相似文献
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《四川农业大学学报》2014,(3):311-314
【目的】对贵州省36个县市的1 547份疑似病毒病症状的烟叶样品进行检测,明确我省烟区主要病毒种类。【方法】采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)法。【结果】检测出1 107个阳性样品,包括烟草普通花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)、马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)、烟草脉带花叶病毒(tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)等5种病毒,其中TMV和PVY的阳性检出率较高,分别为41.63%和11.70%;并以单一病毒侵染为主,另有4种类型的复合侵染。【结论】通过研究可知TMV和PVY为贵州烟草病毒病的优势毒原种类。 相似文献
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《农业科学学报》2017,(1)
Aphid-borne Zucchini yellow mosaic virus(ZYMV) is one of the most economically important viruses of cucurbitaceous plants.To survey and control this virus,it is necessary to develop an efficient detection technique.Using purified ZYMV virion and the conventional hybridoma technology,three hybridoma cell lines(16A11,5A7 and 3B8) secreting monoclonal antibodies(MAbs) against ZYMV Zhejiang isolate were obtained.The working titers of the ascitic fluids secreted by the three hybridoma cell lines were up to 10~(-7) by indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).All MAbs were isotyped as lgG1,kappa light chain.Western blot analysis indicated that the MAb 3B8 could specifically react with the coat protein of ZYMV while MAbs 5A7 and 16A11 reacted strongly with a protein of approximately 51 kDa from the ZYMV-infected leaf tissues.According to this molecular weight,we consider this reactive protein is likely to be the HC-Pro protein.Using these three MAbs,we have now developed five detection assays,i.e.,antigen-coated-plate ELISA(ACP-ELISA),dot-ELISA,tissue blot-ELISA,double-antibody sandwich ELISA(DAS-ELISA),and immunocapture-RT-PCR(IC-RT-PCR),for the sensitive,specific,and easy detection of ZYMV.The sensitivity test revealed that ZYMV could be readily detected respectively by ACP-ELISA,dot-ELISA,DAS-ELISA and IC-RT-PCR in 1:163840,1:2560,1:327680 and 1:1 310720(w/v,g mL~(-1)) diluted crude extracts from the ZYMV-infected plants.We demonstrated in this study that the dot-ELISA could also be used to detect ZYMV in individual viruliferous aphids.A total of 275 cucurbitaceous plant samples collected from the Zhejiang,Jiangsu,Shandong and Hainan provinces,China,were screened forthe presence of ZYMV with the described assays.Our results showed that 163 of the 275 samples(59%) were infected with ZYMV.This finding indicates that ZYMV is now widely present in cucurbitaceous crops in China.RT-PCR followed by DNA sequencing and sequence analyses confirmed the accuracy of the five assays.We consider that these detection assays can significantly benefit the control of ZYMV in China. 相似文献
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Monoclonal antibody-based serological detection of potato virus M in potato plants and tubers 
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下载免费PDF全文 ZHANG Yu GAO Yan-ling HE Wan-qin WANG Ya-qin QIAN Ya-juan ZHOU Xue-ping WU Jian-xiang 《农业科学学报》2020,19(5):1283-1291
Potato virus M(PVM) is one of the common and economically important potato viruses in potato-growing regions worldwide. To investigate and control this viral disease, efficient and specific detection techniques are needed. In this study, PVM virions were purified from infected potato plants and used as the immunogen to produce hybridomas secreting PVM-specific monoclonal antibodies(MAbs). Four highly specific and sensitive murine MAbs, i.e., 1 E1, 2 A5, 8 A1 and 17 G8 were prepared through a conventional hybridoma technology. Using these four MAbs, we have developed an antigen-coated plate(ACP)-ELISA, a dot-ELISA and a Tissue print-ELISA for detecting PVM infection in potato plants and tubers. PVM could be detected in infected potato plant tissue crude extracts diluted at 1:10 240(w/v, g mL~(–1)) by the dot-ELISA or at 1:163 840(w/v, g mL~(–1)) by the ACP-ELISA. The Tissue print-ELISA is the quickest and easiest assay among the three established serological assays and is more suitable for onsite large-scale sample detection. Detection results of the field-collected samples showed that PVM is currently widespread in the Yunnan and the Heilongjiang provinces in China. The field sample test results of the developed serological assays were supported by the results from RT-PCR and DNA sequencing. We consider that the newly established ACP-ELISA, dot-ELISA and Tissue print-ELISA can benefit PVM detection in potato plant and tuber samples and field epidemiological studies of PVM. These assays can also facilitate the production of virus-free seed potatoes and breeding for PVM-resistant potato cultivars, leading to the successful prevention of this potato viral disease. 相似文献
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《农业科学学报》2017,(4)
Citrus yellow vein clearing virus(CYVCV) is considered as the causal agent of Citrus yellow vein clearing disease and belongs to the genus Mandarivirus in the family Alphaflexiviridae.Capsid protein(CP) of CYVCV Chongqing isolate(CYVCVCQ) was produced using a prokaryotic expression system and used as the immunogen for monoclonal antibody(MAb)production.Four highly specific and sensitive murine MAbs and one polyclonal antibody were prepared in this study.Titers of the four MAbs in ascites fluids ranged from 10~(-6) to 10~(-7) as determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Three serological assays,including dot enzyme-linked immunosorbent assay(dot-ELISA),tissue blot-ELISA,and double-antibody sandwich(DAS)-ELISA,were developed for quick and reliable detections of CYVCV in citrus samples.The developed dot-ELISA and DAS-ELISA methods could detect CYVCV in the infected citrus leaf crude extracts diluted at 1:2560and 1:10240(w/v,g mL~(-1)),respectively.The detection result of 125 citrus leaf samples collected from citrus groves in Yunnan Province and Chongqing Municipality of China showed that approximately 36%samples were positive for CYVCV.This virus was,however,not detected in any sample collected from Zhejiang or Jiangxi Province,China. 相似文献
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【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVYN及PVYO样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。 相似文献
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Three sensitive and reliable serological assays for detection of potato virus A in potato plants 下载免费PDF全文
下载免费PDF全文 Vegetative propagation of seed potato often allows passaging of viruses to seed tubers, resulting in significant yield losses and reduction of potato tuber quality. Thus, virus detection approach is crucial for effective virus management programs and the production of virus-free seed potatoes. Among the reported potato-infecting viruses, potato virus A (PVA) is considered as one of the most important viruses in potato-growing regions worldwide. This study prepared four hybridoma lines secreting PVA-specific monoclonal antibodies (MAbs) (2D4, 8E11, 14A6 and 16H10) using purified PVA virions as an immunogen. Western blotting results indicated that all the four MAbs reacted strongly and specifically with the putative capsid protein of PVA. Using these four MAbs, this study developed antigen-coated plate enzyme-linked immunosorbent assay (ACP-ELISA), Dot-ELISA and Tissue print-ELISA for detection of PVA infection in potato plants. The results indicated that PVA can be detected in crude tissue extracts from infected potato plants diluted up to 1:327680 (w/v, g mL–1) by ACP-ELISA or up to 1:10240 by Dot-ELISA. The Tissue print-ELISA is the quickest and easiest approach among the three serological assays, and is more suitable for onsite large-scale potato screening programs. Further analyses of field-collected potato samples showed that the sensitivities and specificities of the three serological approaches were similar to those of RT-PCR in PVA detection and confirmed that PVA is currently widespread in Yunnan and Zhejiang provinces of China. Hence, the results strongly suggest that these highly sensitive serological approaches based on PVA-specific MAbs are useful and powerful for PVA-free seed potato production programs and PVA field surveys. 相似文献
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基于线粒体DNA-COI序列的禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】设计禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）和菲利普孢囊线虫（Heterodera filipjevi）特异性引物,建立同步快速检测这两种线虫的双重PCR体系,为中国小麦孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）的田间快速诊断与综合治理提供技术支持。【方法】通过比对分析10种植物寄生线虫24个群体的线粒体DNA（mtDNA）COI序列,分别设计并筛选禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的上游特异性引物HaF8和HfF9,以及下游通用引物HafR8;通过引物浓度比和退火温度的优化,建立针对这两种CCN的双重PCR检测体系;利用该体系对中国黄淮麦区部分CCN样品进行种类鉴定。【结果】筛选并获得的特异性引物HaF8/HafR8及HfF9/HafR8,可在一步PCR反应中实现对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性检测。引物HaF8/HafR8对禾谷孢囊线虫的特异性扩增产物为200 bp,而HfF9/HafR8对菲利普孢囊线虫的特异性扩增产物为320 bp,条带区分较明显。对双重PCR检测体系的优化发现,引物HaF8、HfF9、HafR8的退火温度为58℃时,该检测体系具有较高的特异性和扩增效率;引物HaF8﹕HfF9﹕HafR8浓度比为0.24﹕0.16﹕0.4 μ·L-1时,该检测体系能从不同供试线虫中同时特异性地检测出禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫,且扩增效率较高。该检测体系对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单孢囊的检测灵敏度为1/2 000 000个孢囊,而对2龄幼虫的检测灵敏度则分别为1/640条线虫和1/1 280条线虫。对采集自中国黄淮麦区CCN病田的14份土样进行双重PCR检测,发现有8个样本只扩增出200 bp的条带,表明这些样本的CCN种类为禾谷孢囊线虫,有4个样本只扩增出320 bp的条带,表明CCN种类为菲利普孢囊线虫,2个样本同时扩增出200和320 bp两个条带,表明样品为禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的混合发生。以上结果表明,该检测体系可以成功用于两种小麦孢囊线虫田间复合侵染情况的快速诊断。【结论】基于mtDNA-COI序列开发的特异性引物以及建立的双重PCR检测体系,可用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫田间单一和混合发生样本的同步快速检测。 相似文献
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辣椒脉斑驳病毒的多基因联合检测与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-PCR方法对印度进境辣椒进行检测以确定是否携带有ChiVMV。根据ChiVMV外壳蛋白（coat protein,CP）和圆柱状内含体蛋白（cytoplasmic inclusion protein,CI）保守区域分别设计引物,筛选两个基因（CP和CI）的特异性引物组合,通过设定不同的引物用量组合以及对退火温度等条件进行优化,探索最佳的反应条件,建立多基因联合检测方法。利用建立的多基因联合检测体系对包含ChiVMV在内的辣椒病毒进行检测,以验证该体系特异性。同时对ChiVMV阳性样品的不同浓度cDNA进行扩增,测定其检测灵敏度。此外,对田间辣椒样本进行检测,以验证体系的实际应用效果。【结果】通过对印度进境辣椒的DAS-ELISA检测,发现样品提取液与ChiVMV呈阳性反应;利用CP861-F/CP861-R特异性引物对进行RT-PCR,扩增出与预期大小相一致的特异性片段,确认该批辣椒样品携带有ChiVMV。多基因联合检测体系中,应用引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R分别扩增出长度为337、655 bp的特异性目的片段。经优化后的反应体系和程序为cDNA 2 μL、CP337-F/CP337-R各0.625 μL（10 μmol·L-1）、CI655-F/CI655-R各1.375 μL（10 μmol·L-1）、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 6.5 μL,退火温度50℃,共35个循环。建立的多基因联合检测方法具有良好的特异性和灵敏度,两个基因检测灵敏度均为10-4数量级。实际应用检测结果表明,该方法可从感染ChiVMV的样品中同时扩增出CP和CI的特异性目的片段。【结论】建立的多基因联合检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,可为辣椒脉斑驳病毒的快速检测提供可靠的技术支持。 相似文献
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抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br# 总被引：4，自引：4，他引：0
【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng•mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng•mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。 相似文献