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1.
[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。 相似文献
2.
【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列（GenBank登录号：EU870890）为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至pEASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测。【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519-+82 bp,且在-220-+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE 1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域（-519-+82bp）,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。 相似文献
3.
关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】生肌决定因子(myogenic determination gene,MyoD)家族是肌肉生成过程中参与分子调控作用的一个重要家族。该家族包括MyoD1,Myf5,MyoG和Myf6,只表达在成熟的骨骼肌细胞和其前期细胞中;在其他的非肌细胞中, MyoD基因家族会被抑制。该家族中,MyoD1负责早期胚胎成肌祖细胞的激活并参与胚后骨骼肌的生长、发育和修复等方面的调节,以维持个体骨骼肌的相对稳定,是启动和维持骨骼肌细胞分化和生长的重要因素,具有尤为重要的作用,已成为研究热点。目前MyoD1在多态性和关联性分析等方面的研究较多,表达调控方面主要是研究小鼠、鸡和猪肌细胞生成机理;在牛上对它的研究主要在转录后和翻译水平的表达情况,但对MyoD1在转录调控方面的作用机制还不明确。文章研究关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响,为探讨牛MyoD1的表达调控机制奠定基础。【方法】通过设计特异性引物克隆关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子片段P1和P2;同时利用双酶切的方法分别将CDS区和克隆的启动子序列连入pcDNA3.1（+）和pGL3-Basic基本骨架,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG和含萤火虫荧光素酶报告基因的报告载体pGL3-P1、pGL3-P2。重组质粒经酶切和测序鉴定后,利用共转染的方法将真核表达载体和报告载体转染小鼠C2C12细胞,30 h后裂解细胞并检测细胞裂解液的双荧光素酶活性。最后根据荧光素酶的相对活性来分析 MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响。【结果】克隆得到的关岭牛 MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子序列测序正确,载体pcDNA3.1（+）-Myf5、pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG、pGL3-P1和pGL3-P2经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;与相应剂量的对照组相比,转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD后,pGL3-P1的相对荧光素酶活性明显增强,其中,在转染量为200 ng时增强作用最强,差异显著(P＜0.05);转染pcDNA3.1（+）-MyoG后,虽然对pGL3-P1的相对荧光素酶活性有增强作用,但差异不显著(P＞0.05);而转染pcDNA3.1（+）-Myf5、 pcDNA3.1（+）-Myf6、pcDNA3.1（+）-MyoD、pcDNA3.1（+）-MyoG后,pGL3-P2的相对荧光素酶活性变化不明显 (P＞0.05)。【结论】在小鼠C2C12细胞中外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1启动子全长P1的转录活性(P＜0.05);而外源过表达转录因子 MyoD基因家族不能显著提高关岭牛MyoD1启动子核心区P2的转录活性。说明关岭牛MyoD、Myf5和Myf6转录因子与关岭牛MyoD1启动子的作用位点不在其核心启动子区P2上。 相似文献
4.
采用PCR 技术扩增牛MSTN 基因启子,亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建重组报告载体pGL3-Basic- MSTN-promoter。将重组报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter 与内参质粒pRL-TK 用脂质体法瞬时共转染小鼠成肌细胞系C2C12 和小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1,通过双荧光素酶活性检测其启动子活性遥测序结果表明,成功构建了牛MSTN 基因真核报告载体pGL3-Basic-MSTN-promoter,瞬时转染试验表明,pGL3-Basic-MSTN-promoter在C2C12细胞和3T3-L1 细胞中的启动子活性分别为pGL3-Basic空载体的14.53 倍尧5.02 倍。研究结果为进一步研究MSTN 基因的表达调控机制奠定了基础。 相似文献
5.
[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。 相似文献
6.
【目的】克隆p7TP2基因的启动子区域,并检测HCV p7TP2启动子的转录活性。【方法】通过分析确定p7TP2基因翻译起始密码子ATG上游1 203 bp至下游147 bp的基因组DNA序列作为启动子,克隆启动子片段并构建载体pCAT3-p7TP2-p和pGLB-p7TP2-p,转染HepG2细胞,应用CAT表达系统和双荧光素酶系统检测启动子活性。【结果】克隆了预测具有启动子活性的片段,成功构建了pCAT3-p7TP2-p和pGLB-p7TP2-p载体,转染pCAT3-p7TP2-p的HepG2细胞,CAT表达活性是转染pCAT3-Basic细胞的5.98倍;转染pGLB-p7TP2-p的HepG2细胞,双荧光素酶表达活性是转染pGLB细胞的9.67倍。【结论】克隆的p7TP2启动子序列与预测的序列一致,并且具有启动子转录活性。 相似文献
7.
【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。 相似文献
8.
旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制。采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到p EGFP-N1和p GL3-Basic载体,构建重组载体。将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化。双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370~-36 bp,在-370~-166 bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性与对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著。本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考。 相似文献
9.
【目的】通过克隆粘虫Mythimna separata(Walker)(Lepidoptera:Noctuidae)中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,并分析启动子功能,为进一步探索昆虫胰蛋白酶活性调控机制奠定基础。【方法】利用Genome Walking方法克隆粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,运用在线分析软件NNPP v.2.2和数据库JASPAR进行序列分析,构建由胰蛋白酶基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体,通过转染草地贪夜蛾sf21细胞系,瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】克隆得到粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列1 863bp,其中含TATA框、CAAT框等启动子核心序列及GATA、STAT、C/EBP等转录调控元件。双荧光素酶报告基因检测系统分析表明,相对于空载体pGL3-Basic,所构建的重组载体p(-1 673/+25)具有明显的启动子活性。【结论】克隆得到的启动子片段明显具有启动报告基因表达的能力,可用于在胰蛋白酶基因启动子水平和转录因子水平研究杠柳新苷活性化合物的激活机理。 相似文献
10.
【目的】构建美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,为探索CYP321 A1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】设计合成PCR引物,从美洲棉铃虫基因组DNA中扩增并克隆CYP321 A1基因的启动子区;将克隆的启动子片段插入载体pGL3-basic构建萤火虫荧光素酶报告基因载体p(-1 470/+64);用p(-1 470/+64)转染美洲棉铃虫脂肪体细胞系BCIRL-HzFB33,并用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】p(-1 470/+64)经双酶切、PCR鉴定及DNA测序分析鉴定准确无误;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,证实所构建的重组载体p(-1 470/+64)可以反映CYP321 A1启动子活性;黄酮、花椒毒素处理极显著地增强了重组载体p(-1 470/+64)的荧光活性。【结论】成功构建了美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,CYP321A1启动子活性可以被植物次生物质黄酮、花椒毒素高度诱导。 相似文献
11.
【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体（-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp）,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因 5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110--625启动子活性最强,且-625--1和-625--1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。 相似文献
12.
角蛋白启动子荧光素酶表达载体的构建及其表达活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
角蛋白14(K14)和角蛋白5(K5)主要在毛囊基质和复层鳞状上皮基底层的角质细胞里表达。这两个启动子已被广泛应用于毛囊特异表达外源基因的转基因小鼠模型的研究中,为了能将其应用于转基因绵羊生产,探讨基因对绵羊毛囊发育的影响,从人基因组中克隆得到K14和K5启动子,利用不同的报告基因在细胞水平分析各启动子的表达活性。结果表明,这两个启动子在不同细胞系中都能驱动外源基因的表达,而且K14启动子在小鼠皮肤细胞系JB6-C41中的表达活性高于其他细胞。 相似文献
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牛Nramp1基因启动子的克隆及其活性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】牛Nramp1基因是主要的抗病候选基因,但其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究欲确定牛Nramp1基因的启动子区域,找到启动子核心序列和主要的调控区,探索Nramp1基因表达机制。【方法】采用基因克隆、DNA测序、半定量RT-PCR和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建牛Nramp1基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同节段的pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒,分别转染293T和RAW264.7细胞,并进行脂多糖(LPS)诱导,对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定。【结果】牛Nramp1基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,+58—-89区域具有基本的启动子功能,+58—-1 748启动子活性最强。进一步研究表明,-89—-205 bp区域、 -278—-1 495 bp区域存在着正调控元件,在-205—-278 bp区域内存在着负调控元件;另外,LPS能显著增强启动子活性,其诱导牛Nramp1基因的表达具有细胞特异性和剂量依赖性。【结论】成功构建了含推测的牛Nramp1基因启动子片段的重组报告基因载体, 确定了启动子核心区域和主要的调控区域。 相似文献
14.
【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。 相似文献
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绵羊Dlx3基因启动子活性及其多态性与羊毛品质性状的关联 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】通过开展绵羊Dlx3基因启动子结构、活性、多态性及其与羊毛品质性状的关联等分析,揭示Dlx3基因在绵羊毛囊发育中的作用及其作用机制。【方法】采用PCR扩增Dlx3基因起始密码子上游1.5 kb区域,利用荧光素酶报告基因技术分析Dlx3基因启动子活性,采用测序方法寻找Dlx3基因启动子区SNP,并利用PCR-RFLP技术进行SNP分型。【结果】①Dlx3基因启动子近端序列的保守性较高,该区域内人、鼠及绵羊都具有23个保守的转录因子结合位点和一个CpG岛,而启动子的远端序列的保守性较低;②Dlx3基因的启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中具有启动子活性;③Dlx3基因启动子的-1 551—-1 108 bp与-1 108—-707 bp区域对启动子活性影响较大;④Dlx3基因启动子区SNP位点（G-1166A）多态性与羊毛卷曲度显著相关。【结论】①Dlx3基因启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中有活性;②Dlx3基因启动子的近端序列组成在人、鼠和绵羊中较为保守,而其远端序列的保守性较低,但是Dlx3基因启动子的远端序列对启动子活性影响较大;③Dlx3基因启动子区G-1166A位点是羊毛卷曲度的一个分子标记。 相似文献
16.
家蚕中肠特异启动子BmAPN的克隆及活性分析 总被引：2，自引：2，他引：0
【目的】克隆和鉴定1个家蚕中肠特异启动子,为研究家蚕的免疫应答和应用研究提供新的工具。【方法】从家蚕品种大造中提取基因组总DNA,用PCR方法克隆家蚕中肠特异表达基因BmAPN（GenBank登录号：BAA33715.1）的上游调控序列。利用此序列构建以EGFP为报告基因的转基因表达载体pBac[BmAPN-EGFP-SV40,3×P3-DsRed],通过显微注射获得转基因家蚕,在个体水平上检测启动子的活性。【结果】所克隆的BmAPN启动子长度为1 598 bp,其驱动的EGFP仅在转基因家蚕中肠特异表达,与内源基因BmAPN的表达特征一致。该启动子在家蚕幼虫时期活性相对较高,且在起蚕期的活性要明显高于眠蚕期,推测该启动子中的特异元件受激素调控。【结论】经克隆获得的BmAPN启动子为有活性的启动子,且为家蚕中肠特异启动子。 相似文献
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【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果（Malus×domestica）上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA（E-value<3e -40）,分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1 500 bp作为候选U6启动子。序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件（Upstream sequence element,USE）和TATA-Like box。瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子（长度分别为1 500、959、275和116 bp）中275 bp的启动子活性最强。另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子。【结论】从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子。 相似文献