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1.
根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。 相似文献
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本试验旨在构建一种以不同分支杆菌特异片段为目的基因的多重PCR检测方法。采用GenBank公布的结核分支杆菌RD10序列、牛分支杆菌moaB3序列、鸟分支杆菌16-23SrDNA序列设计并合成特异性引物,扩增产物条带分别为954bp、297bp、119bp。结果显示,三段目的基因都有很高的特异性,对比菌株均无扩增产物出现。对倍比稀释的模板质粒进行检测,该方法的最低检出量为103 copies/μL的DNA模板,该方法特异、敏感、重复性好。首次应用的moaB3基因所得扩增效果良好,成功区分出牛分支杆菌。此多重PCR方法可用于结核分支杆菌、牛分支杆菌、鸟分支杆菌的鉴别和牛结核病的快速临床检测。 相似文献
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根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp：该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10—7Hg／mL,是单一PCR的10^3倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。 相似文献
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应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎 总被引：1，自引：1，他引：1
根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp:该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10-7μg/mL,是单一PCR的103倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。 相似文献
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本研究旨在比较5种DNA提取方法对绵羊血液中布氏杆菌DNA的提取效果及对PCR检测的影响。将不同浓度的疫苗株布氏杆菌加入绵羊全血中,采用3种DNA提取试剂盒和酚/氯仿法以及碘化钠法等5种方法提取模拟的绵羊血液样品中的DNA,评价所获得DNA的浓度、纯度和完整性,并采用布氏杆菌特异性PCR进行检测。同时,对各提取方法所需时间及经济成本进行了比较。结果表明,各方法均能提取获得绵羊全血中布氏杆菌DNA,3种试剂盒和碘化钠法获取布氏杆菌DNA的效果相同,而酚/氯仿法获取布氏杆菌DNA的效率最低或存在PCR抑制剂而不适合用于绵羊血液中布氏杆菌的PCR检测。碘化钠法具有耗时较短、成本低、方便的优点,是从绵羊血液中提取布氏杆菌DNA的良好方法。本研究结果为临床绵羊血液中布氏杆菌DNA提取方法的选择提供了参考。 相似文献
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牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2014,(15)
为了研究牛布氏杆菌血清抗体快速诊断方法,试验采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31基因,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌DE3进行诱导表达,再将表达产物重组外膜蛋白OMP31纯化后作为抗原,建立检测牛布氏杆菌血清抗体的OMP31-ELISA,并对最适反应条件进行确定,然后对从河北省部分牛场采集的150份腹泻奶牛血样进行血清抗体检测。结果表明:牛布氏杆菌OMP31蛋白成功表达,表达产物能与牛布氏杆菌免疫兔血清反应;建立的OMP31-ELISA最佳工作条件为外膜蛋白OMP31抗原的最适包被浓度2.0μg/mL,酶标抗体的工作浓度1∶400,血清稀释度1∶160,以3%明胶-PBS封闭30 min。检测的150份临床血清样本中,特异性、敏感性和符合率分别为90.91%(50/55)、95.79%(91/95)、94.00%(141/150)。说明本方法特异性强、敏感性高,快速,使用方便。 相似文献
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根据GenBank中的牛结核分枝杆菌IS6110的基因片段,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,研制了用于检测牛结核病的PCR试剂盒,该试剂盒扩增的阳性条带为317 bp;敏感性结果显示,该PCR检测试剂盒的最低核酸检测量为1.025 pg/μL;特异性试验表明,仅结核分枝杆菌扩增结果为阳性,副结核分枝杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金葡萄球菌、链球菌的扩增结果均为阴性。-20 ℃至少可保存12个月,且重复性良好。应用该PCR试剂盒对24份临床样本进行了检测,其PCR检测结果与结核菌素试验检测结果相一致。结果表明,牛结核病PCR检测试剂盒能够对牛结核临床样本进行快捷、灵敏、准确的检测。 相似文献
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布氏杆菌和结核杆菌二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用 总被引：3，自引：1，他引：3
本试验旨在利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布氏杆菌和结核杆菌的方法。通过筛选布氏杆菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性和敏感性试验,并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布氏杆菌的omp25基因与结核杆菌cfp10基因引物组合最佳,该二重实时荧光定量PCR方法中布氏杆菌Tm值为88～89℃,结核杆菌Tm值为90～91℃,对其他供试的菌株则为阴性;该方法对布氏杆菌的DNA最低检出量为20拷贝.μL-1,结核杆菌为50拷贝.μL-1,两病原都存在时为100拷贝.μL-1,比常规PCR高100倍。利用所建立的二重荧光定量PCR方法及常规PCR,对24份结核痰样、11份布氏杆菌基因粗提物及30份模拟奶样进行检测,符合率为100%。本试验建立的方法可用于同时检测布氏杆菌和结核杆菌,并且具有良好的特异性、敏感性和稳定性。 相似文献
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以表达新疆绵羊种布鲁氏菌外膜抗原蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b,探索其作为诊断抗原和分子疫苗的可能性。采用PCR扩增技术,从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组DNA中扩增出OMP2b基因片段,将该片段克隆于原核表达载体PE-28a(+),构建成重组质粒,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测有无蛋白的表达。结果表明,获得长约1 083bp的PCR片段,序列分析结果与已知绵羊种OMP2b同源性达89.72%;SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量39 ku获得了新疆绵羊种布鲁氏菌外膜蛋白OMP36的表达蛋白OMP2b基因片段,并在大肠杆菌中实现了表达。 相似文献
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根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成了3对引物,以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板,通过优化反应条件,建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带,羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带,该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg,对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测,虎红平板凝集试验作对照,结果PCR检测9份为阳性,且全为牛种布鲁菌阳性,对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明,建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性,为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。 相似文献
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副猪嗜血杆菌OMP P2基因的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
利用已分离的菌株HB070412,根据NCBI上GenBank中的HPS序列（ZP_02477753）设计了1对引物,用PCR方法扩增了副猪嗜血杆菌外膜蛋白中的穿孔素前体蛋白P2基因（OMP P2）,并克隆到载体pMD18-T（T-Vec-tor）,序列测定结果表明OMP P2基因全长1 077bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与所报道的HPS OMPP2基因之间的核苷酸序列同源性为98.1%,氨基酸序列同源性为95.5%。用pGEX-6p-1构建了原核表达载体pGEX-P2,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的50%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约为65 000,Western blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。 相似文献
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设计1对特异性引物对羊布鲁菌16M总DNA进行外膜蛋白omp10的PCR扩增,得到了一个大小为330 bp的目的基因片段(去掉17个氨基酸编码的信号肽),测序证实它与国外报道的羊布鲁菌omp10基因完全一致.将其克隆到表达载体PET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功.将此重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,该基因以包涵体的形式在大肠埃希菌中表达,经过包涵体的变性、复性和亲和层析纯化,成功获得大小为14.2 ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Western blot和间接ELISA试验证明,纯化之后的OMP10重组蛋白可以被布鲁菌阳性血清识别. 相似文献
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布鲁氏菌内蒙古分离株omp31基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
对三株布鲁氏菌内蒙古分离株的omp31基因进行克隆与序列分析.参照GenBank中布鲁氏菌的omp31基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增布鲁氏菌omp31基因,对PCR产物进行克隆、测序,将测定序列拼接后与GenBank中获得的参考毒株omp31基因序列进行了比较.结果显示,三株布鲁氏菌分离株的omp31基因开放阅读框核苷酸序列同源性均为100.0%;与Brucella ceti B14/94、Brucella neotomae 5K33、Brucella suis 1330三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最高,为100.0%;与Brucella canis RM6/66、Brucella melitensis 183、Brucella melitensis 16M三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.9%;与Brucella melitensis Rev1参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.6%;与Brucella ovis ATCC 25840参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最低,为98.8%. 相似文献
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Comparison of polymerase chain reaction and bacteriological culture for the diagnosis of sheep brucellosis using aborted fetus samples 总被引：1，自引：0，他引：1
PCR assay has been shown to be a promising option for the diagnosis of brucellosis. However, few studies have been performed with field samples in order to evaluate the assay as a diagnostic tool. In this study, routine use of a species-specific PCR assay previously developed for the identification of Brucella cultures was assessed for the detection of Brucella DNA directly from the stomach contents of aborted sheep fetuses. The assay is based on the insertion sequence IS711 in the Brucella chromosome. In the study, during 3 successive lambing seasons (1998-1999, 1999-2000 and 2000-2001) 126 aborted fetus samples each from different flocks and locations were examined. Brucella strains were isolated from 39 (31%) of the samples and all of the strains were identified as Brucella melitensis by biochemical characteristics, agglutination with monospecific A and M sera and PCR. Thirty-seven of 39 B. melitensis isolates were biotyped as biotype 3, and 2 isolates as biotype 1. From 38 of 39 culture positive fetal stomach contents B. melitensis-specific DNA was detected by PCR. PCR was found negative in all of the culture negative samples. Compared with culture, sensitivity and specificity of PCR were determined as 97.4 and 100%, respectively. The results indicate that this PCR procedure has a potential for use in routine diagnosis of sheep brucellosis. 相似文献
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布鲁氏菌外膜蛋白OMP15.6表达及免疫反应原性测定 总被引：2，自引：0，他引：2
表达羊布鲁氏菌16M预测外膜蛋白OMP15.6,探索其作为诊断抗原的可能性。采用降落PCR方法,从羊布鲁氏菌16M基因组DNA中扩增出423bp的基因片段,将该片段克隆于原核表达载体PGEX-4T-2,构建重组表达载体。经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,结果表明,在大肠杆菌中成功表达了外膜蛋白OMP15.6。经West-ern-blotting检测,该蛋白能与豚鼠抗布鲁氏菌阳性血清发生特异性免疫反应,为其之后的抗原性以及免疫原性研究奠定了良好的基础。 相似文献