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在植物生长发育中,CIPKs(CBL-interacting protein kinases)在胁迫信号转导和增强抗逆途径中发挥着重要作用,而OsCIPK5的具体功能还未知。为了研究OsCIPK5的功能,本研究从日本晴水稻中成功克隆了OsCIPK5基因。用生物信息学方法对其编码的蛋白进行分析,结果表明OsCIPK5含有2个功能区即激酶活性区和NAF区,OsCIPK5与5种植物的CIPK5同源性较高,而与短花药野生稻CIPK5的同源性最高(94%),亲缘关系最近。利用植物生理学方法对水稻进行低钾处理,结果表明水稻根中OsCIPK5受低钾诱导表达,而叶片中OsCIPK5表达量没有变化;同时构建了OsCIPK5与黄色荧光蛋白基因融合的植物瞬时表达载体,共聚焦显微镜观察显示,OsCIPK5编码的蛋白主要定位在细胞核、细胞膜,还以颗粒状结构不规则分布在细胞质中。进一步构建了OsCIPK5的RNAi载体,通过水稻遗传转化体系获得26株阳性转基因水稻。荧光定量PCR(Real-time qPCR)分析表明,T1代转基因水稻中OsCIPK5的表达量与野生型相比显著降低。OsCIPK5的生物信息学分析、植物生理学分析、亚细胞定位以及RNAi转基因水稻的获得为研究OsCIPK5的功能奠定了基础。 相似文献
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【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶Vv CIPK10,分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式,为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能,探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得Vv CIPK10序列,设计特异引物进行RT-PCR反应,对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析;构建原核表达载体,转化表达菌株后用IPTG进行诱导表达,收集菌体后裂解细胞,制备蛋白上样液,SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,同时对融合蛋白进行可溶性分析;IPTG大量诱导表达融合蛋白,收集菌体后进行超声破碎细胞,用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化MBP-Vv CIPK10融合蛋白,SDS-PAGE电泳进行分析;纯化后的融合蛋白与体外自磷酸化缓冲液进行自磷酸化反应,反应后SDS-PAGE电泳,压磷屏检测体外自磷酸化反应;构建重组瞬时表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10;分离拟南芥原生质体,通过PEG介导的瞬时转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至原生质体;通过基因枪介导的转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至洋葱表皮细胞,培养16 h后用激光共聚焦显微镜进行荧光信号检测;选择生长相对一致且健壮的葡萄植株,于干旱、低温和盐胁迫处理后不同时间取样,同时在田间取葡萄不同组织样品,实时荧光定量PCR检测Vv CIPK10在葡萄不同组织中的表达以及在不同逆境胁迫下的表达模式。【结果】PCR克隆获得葡萄Vv CIPK10全长为1 357 bp,5′端非编码区为30 bp,3′端非编码区为156 bp,开放阅读框为1 171 bp,编码436个氨基酸,理论等电点为8.59,分子量为48.7 k Da。保守结构域预测分析显示该蛋白5′端具有一个激酶结构域,3′末端具有一个PPI结构域和一个NAF结构域。BLSATP分析表明葡萄Vv CIPK10与桃树CIPK(XP_007205151)一致性最高(74%)。重组表达载体p MAL-C5X/Vv CIPK10在大肠杆菌中经诱导表达获得与理论分子量(43 k Da+48.7 k Da)相一致的融合蛋白。MBP-Vv CIPK10融合蛋白经柱纯化后获得单一的蛋白条带,Vv CIPK10的自磷酸化活性依赖于Mn~(2+),不依赖于Mg~(2+)和Ca~(2+),EDTA可以抑制Vv CIPK10的自磷酸化活性。亚细胞定位结果显示,Vv CIPK10定位在细胞核、细胞膜和细胞质。Vv CIPK10在葡萄各个组织中均有表达,主要在葡萄根和叶片中大量表达,葡萄茎、花序、果实和卷须中的表达量较低。在干旱、低温和盐胁迫处理后,Vv CIPK10呈现受诱导表达模式。Vv CIPK10的表达在低温胁迫后6 h达到峰值,干旱和盐胁迫后2 h即达到峰值。【结论】葡萄Vv CIPK10能够响应干旱、低温和盐胁迫,推测Vv CIPK10在葡萄抗非生物逆境胁迫中具有重要作用。 相似文献
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利用亚细胞定位技术对水稻抗白叶枯病相关基因的表达产物进行了分析,为基因功能分析提供了重要信息。通过前期基因芯片筛选、半定量/定量PCR的验证及基因功能注释,从高抗白叶枯病水稻品种Y73中筛选了18个潜在的与抗白叶枯病相关的基因,并在烟草叶片细胞中进行亚细胞定位分析。通过观察融合有绿色荧光标记(sGFP)的表达产物,初步了解这些基因在烟草细胞中的表达位置。经过激光共聚焦显微镜观察后发现: 其中4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞核上,可能发挥了转录因子的功能;4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞质膜上,推测可能与细胞质膜的稳定或控制蛋白转运相关;4个基因的 sGFP 融合蛋白同时定位于细胞核和细胞质膜上;另有6个基因的 sGFP 融合表达后没有观察到明显的定位信号。 相似文献
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为明确拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位情况,本研究构建了AtPLC2基因融合GFP标签的表达载体35S:PLC2-GFP,并通过农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化本氏烟草叶片,转基因烟草叶片细胞利用激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光信号与细胞质膜重合,表明拟南芥AtPLC2基因定位于细胞质膜上,研究结果为明确拟南芥AtPLC2基因的功能奠定了良好的基础。 相似文献
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本研究从花花柴高温表达谱中筛选并克隆蜡质合成相关基因KcFAD2,构建亚细胞定位载体转化烟草进行瞬时表达。亚细胞定位结果表明,绿色荧光主要集中在细胞膜上,并且能够与膜Marker的红色荧光发生共定位,说明KcFAD2蛋白定位在细胞膜上。通过在烟草中超表达KcFAD2基因,结果表明高温处理后KcFAD2转基因烟草的形态学表型、可溶性糖含量和脯氨酸含量均显著高于阴性对照植株,并且其耐高温能力KcFAD2与基因的表达量呈正相关,蜡质含量上升。说明超表达KcFAD2基因提高了烟草的耐高温能力,对荒漠植物抗逆基因资源的挖掘与利用具有应用参考价值。 相似文献
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采用PCR方法从水稻中克隆出1个Na~+/H~+逆转运蛋白基因OsNHX5,构建了该基因的亚细胞定位表达载体,利用注射烟草法对OsNHX5进行亚细胞定位,利用荧光定量PCR技术研究OsNHX5基因在盐胁迫下的表达模式。结果表明,OsNHX5与拟南芥AtNHX5和AtNHX6的亲缘关系较近,该蛋白定位于细胞内膜系统上;荧光定量PCR结果表明,叶中OsNHX5基因的表达受KCl胁迫诱导上调表达,而根中OsNHX5基因的表达变化不明显。OsNHX5是一个细胞内膜系统上的K~+/H~+逆转运蛋白,可为耐盐水稻的分子育种提供理论依据。 相似文献
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[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]对野大麦盐胁迫rbcS基因进行克隆及序列分析。[方法]以盐胁迫下的野大麦幼嫩叶片为试材,根据GenBank中小麦和大麦rbcS基因核酸序列的同源性设计引物,对野大麦基因组DNA进行PCR扩增、回收、连接、转化及测序。[结果]在野大麦的基因组中克隆了2个大小不同的rbcS基因序列rbcS1和rbcS2,长度分别为1252和908bp。rbcS1和rbcS2均由2个外显子和1个内含子组成,外显子长度相等,编码序列为525bp,同源性为96%,编码174个氨基酸;rbcS1和rbcS2内含子大小不同,分别为448和107bp。[结论]为进一步探讨rbcS基因在野大麦耐盐机制中的分子机制奠定了基础。 相似文献
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[目的]探明BC1F3代对亲本(披碱草和野大麦)优良特性的继承情况、杂种优势及育性恢复情况。[方法]重点对披碱草和野大麦及其BC1F3代的农艺性状,包括生育期、生长速度、花粉育性、结实性、再生性和株丛鲜草产量等进行系统的比较研究。[结果]BC1F3代各株系的生长节律趋向于亲本野大麦,不同株系的生育天数有所不同,但都接近轮回亲本野大麦;BC1F3代不同株系花粉育性和结实性有较大差异,但回交后各株系的花粉育性和结实性都有一定程度的提高,YF3-93花粉育性已经超过亲本野大麦,自然结实率也较高。有的株系花粉育性和开放授粉结实率较低,如PF3-52。BC1F3代各株系产草量有较大变异,不同株系间存在明显的差异,如YF3-64、YF3-74和YF3-83的杂种优势分别为75.53%、75.12%和66.16%,而PF3-52、PF3-15、YF3-42产草量不及亲本。[结论]该研究为培育适合干旱、盐渍生境的牧草新品种提供了依据。 相似文献
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DREB类转录因子是一类与植物逆境胁迫响应相关的重要蛋白,本研究利用同源克隆方法和RACE技术从紫大麦草(Hordeum violaceum)中分离到1个DREB类转录因子基因,命名为Hvi917 DREB2。序列分析表明Hvi917 DREB2基因含有1个792bp的开放阅读框,编码264个氨基酸残基,含有1个保守的AP2结构域,属于AP2大家族。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中短芒大麦草AP2蛋白HbDREB2、DREB1(登录号分别为:AAU29412.1和AER42620.1)具有99%的氨基酸序列一致性。将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了1个分子量为34.5kD的蛋白。 相似文献
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[目的]研究强抗寒性牧草——短芒大麦DREB1（dehydration responsive element binding protein1）基因的功能,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定理论基础。[方法]利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,对转基因烟草进行分子生物学鉴定,并对离子渗漏率、脯氨酸表达量生理生化特性进行测定。[结果]HbDREB1整合入烟草基因组,已在转录水平上表达,转基因烟草在冷胁迫条件下的离子渗漏率明显低于对照组,且其脯氨酸表达量明显增高。[结论]HbDREB1基因具有提高植物抗寒性的潜能。 相似文献
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以短芒大麦为材料,应用RT-PCR技术扩增获得792 bp的DREB2基因,构建了重组植物表达载体pBI-DREB2。通过农杆菌转化法将其导入烟草,并利用PCR、PCR-Southern和RT-PCR技术对获得的20株卡那霉素阳性转基因烟草进行分子鉴定。结果表明:短芒大麦DREB2基因已整合到烟草基因组中,并能在转录水平上表达。 相似文献
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[目的]构建矮牵牛PhDFR基因的植物表达载体,并对烟草进行遗传转化。[方法]从不同花色的矮牵牛中克隆了2个PhDFR基因,通过目的基因序列克隆、多步载体酶切、连接、转化等技术手段,将其连入通用植物表达载体pCAMBIA2300及pCAMBIA3301。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌GV3101继而转化烟草。[结果]构建了含卡那霉素抗性筛选标记基因NPT11和除草剂抗性筛选标记基因Bar的GFP融合蛋白植物表达载体pCAMBIA2300-PhDFR-GFP和pCAMBIA3301-PhDFR-GFP。转基因植株的GUS染色结果进一步验证了所构建表达裁体的正确性和实用性。[结论]所构建的表达载体为进一步研究PhDFR基因在植物花色调控效应的功能及开展植物花色改良基因工程研究奠定了基础,为植物基因工程科研工作提供了优良的备选植物表达我体。 相似文献
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在已知短芒大麦DREB1基因3′端序列的前提下,根据其他植物中DREB1转录因子基因序列,首次克隆了短芒大麦全长DREB1基因(899 bp,具有1个编码220个氨基酸的完整阅读框)。序列分析和生物信息学分析表明,该基因具有转录因子的典型特征及AP2/EREBP结构域,并且具有6个丝氨酸、2个苏氨酸、2个酪氨酸磷酸化位点,这可能与翻译后在冷胁迫抗性中发挥作用有关。 相似文献
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分别构建了含全长大豆24 kDa油体蛋白基因、与大肠杆菌热敏毒素B亚基和定居因子CS6 B亚基基因以串联方式融合的全长大豆24 kDa油体蛋白基因、缺失N端74个氨基酸编码序列的油体蛋白基因及缺失C端152个氨基酸编码序列油体蛋白基因等4个大肠杆菌表达载体。除N端缺失的油体蛋白基因外,其它3个载体的IPTG诱导表达产物对E.coli生长表现出明显的抑制作用,菌液浓度与对照菌株相比,至少降低了3倍;而N端缺失了222个编码核苷酸的油体蛋白基因则对宿主细菌细胞的生长繁殖不再表现有任何毒性。进一步通过SDS-PAGE和Western印迹反应检测各表达载体的IPTG诱导表达产物时发现,仅有N端缺失的24 kDa油体蛋白基因片段在宿主细胞BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中有重组油体蛋白积累。 相似文献
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以野大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍｂｒｅｖｉｓｕｂｕｌａｔｕｍ（Ｔｒｉｎ．）Ｌｉｎｋ）的幼根、幼叶为外植体,诱导愈伤组织,建立悬浮细胞系。利用胚性悬浮细胞系进行质壁分离处理再游离原生质体,在不同的光照条件下进行原生质体培养,并由原生质体再生出小细胞团。 相似文献