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1.
采用PCR方法扩增猪细小病毒7型(PPV7)衣壳蛋白基因保守区域493 bp,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒,以其为模板建立用于检测PPV7的SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法,并验证其灵敏性、特异性和重复性。结果表明,本试验建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法在2.85×10^1~2.85×10^8拷贝/μL呈良好的线性关系,相关系数为0.995,斜率为4.158,灵敏度可达到2.85×10^1拷贝/μL。该方法对于猪繁殖障碍性传染病常见病原如PRRSV、PCV2和PRV未出现特异性扩增,表明特异性好。所有标准曲线在溶解温度为83.103℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测了2017年山东地区7家养猪场216份临床样品,总阳性率为12.5%。 相似文献
2.
《中国预防兽医学报》2016,(11)
为建立猪细小病毒(PPV)的快速检测方法,本研究设计了一对针对PPV VP2基因的特异性引物,建立了检测PPV的Eva Green荧光定量PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果表明该方法在104拷贝/μL~108拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;病毒最低检出量为50拷贝/μL,敏感性比常规PCR电泳检测高约100倍;与猪伪狂犬、猪圆环和猪瘟病毒等不发生交叉反应;批内及批间变异系数均小于5%。该方法可以用于PPV的定量检测或临床样品的快速检测。 相似文献
3.
猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×102拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR Green Ⅰ qPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检... 相似文献
4.
《中国预防兽医学报》2017,(6)
为建立犬细环病毒(TTCV)的快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的TTCV ORF7基因设计合成一对特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了检测TTCV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法 Ct值与标准品模板在5.82×10~9拷贝/μL~5.82×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该检测方法仅对TTCV检测为阳性,而对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬副流感病毒均无特异扩增;该检测方法灵敏度可达5.82×103拷贝/μL。对27份犬血清样品检测结果显示,建立的荧光定量PCR阳性检测率为11.11%,而普通PCR方法检测阳性率为3.7%。本实验建立了TTCV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,对TTCV诊断及致病机制的研究提供了高通量的定量检测方法。 相似文献
5.
为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。 相似文献
6.
《猪业科学》2015,(4)
为了建立猪圆环病毒2型(PCV2)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×10~1拷贝/μL,与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2021,(5)
为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10~3拷贝/μL～1.0×10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%～4.41%和0.37%～0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。 相似文献
8.
《中国预防兽医学报》2018,(10)
为建立支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,本研究根据波氏菌属毒力基因DNT设计一对特异性引物,通过优化,确定最佳反应条件,建立了支气管败血波氏杆菌荧光定量PCR检测方法。并对其进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测。以支气管败血波氏杆菌标准质粒为模板,建立标准曲线结果显示:标准品浓度在1.13×10~8拷贝/μL～1.13×10~2拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关数R~2=0.997;该方法的灵敏度可达1.13×10~1拷贝/μL。建立的荧光定量PCR方法与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌等12种细菌和伪狂犬病毒、猪瘟病毒等4种病毒无交叉反应,具有良好的特异性;批内变异系数(CV)均小于2%,批间变异系数均小于4%,具有良好的稳定性。对临床样品的检测结果显示该方法检测的阳性率为57.7%,与普通PCR的符合率为93.24%。本研究建立的方法可以用作支气管败血波氏杆菌感染的早期诊断、快速检测与定量分析。 相似文献
9.
猪细小病毒2型、3型、6型多重PCR检测方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立同时快速检测猪细小病毒2型(PPV2)、猪细小病毒3型(PPV3)、猪细小病毒6型(PPV6)的方法,本研究根据PPV2、PPV3、PPV6各自的NS基因序列设计3对特异性引物,建立了一种能同时检测上述病原的多重PCR方法。结果显示,建立的多重PCR方法对PPV2、PPV3、PPV6的基因组DNA均能有效扩增,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、日本乙型脑炎病毒(JEV)的核酸均无特异性扩增,特异性较强;对PPV2、PPV3、PPV6的重组质粒最低检测限分别为4.32×10^3拷贝/μL、9.62×10^3拷贝/μL、4.25×10^3拷贝/μL,与其他研究者已建立的单一PCR检测结果一致,敏感性较高。利用本研究建立的多重PCR方法对25份可疑临床样品检测,同时利用文献报道的单一PCR方法检测,二者结果一致。本研究建立的多重PCR方法为检测PPV,及该病的流行病学调查提供了技术支持。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2020,(5)
建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×10~0～1.0×10~9拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×10~0拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。 相似文献
11.
《中国畜牧兽医》2016,(7)
本研究根据猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的gE基因序列特点,设计特异性实时荧光定量引物,建立基于SYBR GreenⅠ染料的猪PRV实时荧光定量PCR方法。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法检测猪PRVgE基因在7.53×10~1~7.53×10~6拷贝/μL范围内有较好的线性关系;对猪圆环病毒(porcine circovirus2,PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和猪链球菌(Streptococcus susi)核酸均未见阳性扩增信号;从生成的熔解曲线可见,建立的方法仅对猪PRV检测出现单一特异峰,其熔解温度(Tm值)为(92.9±0.1)℃,PCV2、PPV、副猪嗜血杆菌和猪链球菌均未见特异性峰值;建立的实时荧光定量PCR方法的组内和组间变异系数分别为0.31%~1.14%和0.42%~1.74%。以上结果表明,本研究建立的猪PRV实时荧光定量PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,为深入开展猪PRV对宿主致病机制的研究提供检测手段。 相似文献
12.
《中国预防兽医学报》2016,(11)
为建立一种快速、敏感检测水貂阿留申病毒(AMDV)的方法,本研究根据AMDV的VP2基因保守区设计特异性引物和MGB探针,并优化检测反应条件,建立了AMDV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示,以重组质粒为标准品建立的标准曲线在1.0×10~2拷贝/μL~1.0×10~8拷贝/μL内具有良好的线性关系,相关系数(R~2)为0.998。该方法仅对AMDV的靶基因扩增呈阳性,而对猪细小病毒、犬细小病毒、水貂肠炎细小病毒等相关病毒检测结果均为阴性,特异性良好。该方法对AMDV检测的灵敏度为10拷贝/μL,为普通PCR灵敏度的100倍;组内和组间重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。应用建立方法和普通PCR方法分别对40份疑似临床组织病料样品进行检测,该方法检出率比普通PCR高约7.5%。本研究结果表明建立的AMDV TaqMan-MGB荧光定量PCR方法灵敏、快速、特异性强、重复性好,适用于对AMDV的快速定量检测。 相似文献
13.
为定量分析贵州省临床用猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)活疫苗中病毒含量,根据GenBank中公布的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gB基因序列(登录号:M17321.1)设计1对特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,并对来自6个不同厂家的猪伪狂犬病活疫苗进行含毒量分析。结果显示,试验成功建立了可用于PRV检测的实时荧光定量PCR方法,标准曲线中标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值呈良好的线性关系,标准曲线方程为:Y=-0.97X+33.66(R~2=0.999),该方法最低检测病毒含量为3.19×10~1拷贝/μL,敏感性高且具有良好的重复性和特异性。应用所建立的实时荧光定量PCR方法对贵州省临床用6个厂家生产的猪伪狂犬病活疫苗的病毒含量进行检测,结果显示,6种市售猪伪狂犬病活疫苗(A～F)中病毒含量分别为1.67×10~7、4.83×10~5、2.64×10~6、4.27×10~7、3.39×10~6和3.68×10~5拷贝/μL,来自不同厂家的疫苗病毒含毒量存在明显差异,最大差异可达116倍,其中来自A、D厂家的两种猪伪狂犬病活疫苗具有较高的含毒量。本试验所建立的实时荧光定量PCR方法可用于猪伪狂犬病活疫苗病毒含量的快速检测和评价,对猪伪狂犬病活疫苗的质控和临床用疫苗选择具有一定的指导意义。 相似文献
14.
为定量分析贵州省临床用猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)活疫苗中病毒含量,根据GenBank中公布的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gB基因序列(登录号:M17321.1)设计1对特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,并对来自6个不同厂家的猪伪狂犬病活疫苗进行含毒量分析。结果显示,试验成功建立了可用于PRV检测的实时荧光定量PCR方法,标准曲线中标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值呈良好的线性关系,标准曲线方程为:Y=-0.97X+33.66(R^2=0.999),该方法最低检测病毒含量为3.19×10~1拷贝/μL,敏感性高且具有良好的重复性和特异性。应用所建立的实时荧光定量PCR方法对贵州省临床用6个厂家生产的猪伪狂犬病活疫苗的病毒含量进行检测,结果显示,6种市售猪伪狂犬病活疫苗(A～F)中病毒含量分别为1.67×10~7、4.83×10~5、2.64×10~6、4.27×10~7、3.39×10~6和3.68×10~5拷贝/μL,来自不同厂家的疫苗病毒含毒量存在明显差异,最大差异可达116倍,其中来自A、D厂家的两种猪伪狂犬病活疫苗具有较高的含毒量。本试验所建立的实时荧光定量PCR方法可用于猪伪狂犬病活疫苗病毒含量的快速检测和评价,对猪伪狂犬病活疫苗的质控和临床用疫苗选择具有一定的指导意义。 相似文献
15.
猪流产衣原体实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种快速、准确检测猪流产衣原体(Chlamydophila abortus,C.abortus)实时荧光定量PCR检测方法,根据C.abortus主要外膜蛋白(MOMP)的基因序列设计1对引物和1条分子探针(FAM和Dabycl标记),以构建的重组质粒作为标准阳性质粒,通过筛选和条件优化,建立了猪流产衣原体实时荧光定量PCR诊断方法。重复性、特异性及敏感性试验结果显示,重组质粒为标准品建立的标准曲线在1.0×10~2拷贝/μL~1.0×10~7拷贝/μL内具有良好的线性关系,其相关系数为0.993 2,扩增效率为94.7%,灵敏度达到1.0拷贝/μL,批间批内变异系数(CV)为0.022%~0.051%,建立的方法可有效区分流产衣原体、猪支原体、猪衣原体、肺炎衣原体及猪蓝耳病毒等病原,具有良好的临床应用前景。 相似文献
16.
为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。 相似文献
17.
《中国预防兽医学报》2018,(11)
为建立同时快速鉴别检测羊痘病毒属病毒(CaPV)的方法,本研究设计了一对针对CaPV的通用引物和3条特异性的TaqMan MGB探针,并对其反应条件进行优化,建立了单管同时鉴别检测3种病毒的多重TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该多重荧光定量PCR方法仅对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)有特异性扩增,而对牛痘病毒等其它相关病毒核酸无扩增。在10~2拷贝/μL～107拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;对LSDV、 GTPV、SPPV的最低检测限分别为14.8拷贝/μL、32.9拷贝/μL、26.7拷贝/μL。标准曲线相关系数(R2)均为0.999。批内及批间变异系数均小于1.5%。应用本研究建立的方法和OIE陆生动物手册推荐普通PCR方法分别对185份临床样品和67份模拟样品进行检测,该方法检出率比普通PCR方法高约1.6%。本研究建立的CaPV多重TaqMan-MGB荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便快速等优点,适用于CaPV临床样品的快速鉴别检测。 相似文献
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为建立猪丹毒丝菌的快速检测方法,本研究根据猪丹毒丝菌荚膜多糖的保守区域设计特异性引物,通过优化反应体系建立了检测猪丹毒丝菌SYBR Green I荧光定量PCR方法。并对人工感染小鼠和临床病例样品进行检测。结果显示,质粒标准品在5.52×10~8拷贝/μL～5.52×10~2拷贝/μL范围内呈良好的线性关系;该方法与其它6种猪常见细菌均无交叉反应;最低可检测到20拷贝/μL的阳性质粒标准品,比普通PCR方法敏感性高100倍;批内和批间变异系数均小于3%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以用于猪丹毒的早期诊断和生产实际中大批量临床样品的猪丹毒丝菌检测。 相似文献
19.
猪圆环病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立和初步应用 总被引：2，自引：1，他引：1
为了灵敏而便捷的检测猪圆环病毒3型(PCV3),根据PCV3ORF2基因组保守序列设计合成4对引物,先使用荧光染料(SYBR)定量PCR法验证其能否有效扩增目的片段,并根据结果和引物对所扩增序列的交集进一步设计TaqMan探针,通过优化反应条件和反应体系建立快速检测PCV3的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,SYBR染料法和TaqMan探针法均能有效地扩增PCV3标准质粒以及其他阳性样品,并且对1.29×10~2~1.29×10~9拷贝·μL~(-1)的PCV3标准质粒(Pmd18-t-Cap)呈现良好的线性关系,该方法的检测灵敏度为1.29×10~2拷贝·μL~(-1),比常规PCR的灵敏度高100倍,该方法与猪圆环病毒2型、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒基因以及猪链球菌、猪肺炎支原体等细菌基因均无交叉反应,具有良好的特异性;批次内重复和批次间重复试验结果显示变异系数(CV)均小于1.5%,呈良好的可重复性。用该方法对2016年至2017年间收集的124份来自湖北省等地的猪病料DNA样品进行检测,结果显示本地区PCV3阳性率为8.06%(10/124),PCV2和PCV3共感染率为8.06%(10/124)。上述结果表明,本研究建立TaqMan荧光定量PCR能够灵敏特异的检测圆环病毒3型,为圆环病毒3型的临床检测提供有效手段。 相似文献
20.
《四川畜牧兽医》2021,(5)
为建立一种快速、特异、灵敏的猪圆环病毒3型(PCV3)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了一对特异性引物和探针,通过对反应体系和扩增条件进行优化,建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法。该方法对7.87×10~3～7.87×10~9拷贝/μL的PCV3标准质粒呈现良好的线性关系,最低检出浓度为7.87×10~1拷贝/μL,比常规PCR的灵敏度高100倍。与猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒均无交叉反应,具有良好的特异性。不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验结果均显示变异系数(CV)小于1%,重复性较好。对2018～2020年从四川省不同地区收集的329份正常猪血清及187份疑似PCV阳性临床样品进行检测,得出PCV3阳性率分别为31.3%和38.5%,流行率较高。上述结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测PCV3,为PCV3的临床检测及流行病学调查奠定了基础。 相似文献