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1.
启动子陷阱技术是克隆未知基因启动子的有效途径。首先用反向无启动子的GUSA替换pCAMBIA-2301载体上的GUSA及启动子序列，构建橡胶树启动子陷阱载体pCAMBIA2301：GUS-NOS，然后转化橡胶树。结果表明：获得了GUS染色阳性胚状体6个，再生后获得2个转基因株系。其中1个株系在胚状体、叶片和根中能检测到GUS基因的强烈表达，另1个株系仅在根中检测到微弱的GUS基因表达，说明获得的转基因植株为不同启动子启动GUS基因的株系。因此通过橡胶树启动子陷阱载体的构建及其在橡胶树中的表达，能够发现和克隆橡胶树内源基因的启动子。 相似文献
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在橡胶树中小橡胶粒子蛋白是催化和调控天然橡胶生物合成的重要蛋白因子。根据小橡胶粒子蛋白基因(HbSRPP)的mRNA序列(GenBank登陆号：AF051317)设计引物,利用Genome Walking方法克隆了HbSRPP起始密码子上游1 159 bp的5′调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为68.25 %,含有典型的真核生物核心启动子区域(-141bp-99 bp),一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box、GATA-box也存在序列中,此外还发现一 相似文献
3.
利用Genome Walker方法从巴西橡胶树中克隆了Hb SERK1起始密码子上游1 395 bp的5′调控序列,序列分析表明,该序列A/T含量高达66.2%,符合真核生物启动子序列的特征。Hb SERK1启动子序列中含有多个典型的真核生物启动子基本元件,如:TATA-box,CAAT-box等,同时存在其它应答元件,如:CAT-box、02-site、ERE、ARE、TCA-element、GCN4-motif、ACA-motif等。将Hb SERK1启动子进行5′缺失,并构建了5个植物缺失表达载体。利用真空渗透法和农杆菌介导法将植物缺失表达载体转化烟草,对烟草转化植株进行GUS活性定量分析结果表明,除了SP5外,其它缺失表达载体均可以驱动GUS蛋白的表达,说明在Hb SERK1启动子-1 395~-252 bp区域可以驱动GUS的表达,表明Hb SERK1启动子是具有生物活性的启动子。 相似文献
4.
为深入研究巴西橡胶树HbWRKY1基因的表达调控机制,采用染色体步移法克隆了HbWRKY1基因的5′调控区序列。结果表明,该序列具有预测的核心启动子区域位于-6~-57 bp,转录起始位点位于翻译起始位点上游41 bp处;该序列具有TATA-box,CAAT-box和GATA-box等多个典型的真核生物启动子基本的顺式作用元件,同时还具有低温响应元件LTR,赤霉素反应元件GARE-motif,生长素响应元件TGA-element和脱落酸响应元件ABRE等参与激素调控元件,此外还有与MYB结合的MBS元件,热胁迫反应的HSE,厌氧诱导元件ARE和增强诱发厌氧反应的GC-motif等顺式作用元件。构建了不同长度的HbWRKY1启动子片段的植物表达载体并转化本生烟草, 通过潮霉素抗性和PCR鉴定,获得了转基因植株。对获得的转HbWRKY1不同长度启动子片段的转基因T1植株GUS染色发现,植株的茎、叶柄、主叶脉和根中均可呈现蓝色,表明HbWRKY1基因的5′调控区可以启动GUS基因的表达, 具有启动子的活性。 相似文献
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法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066 bp的5＇调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39 %,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植 相似文献
6.
Northern杂交结果表明,OsSABATH基因受二化螟(Chilo suppressalis)为害诱导表达,但却不受机械损伤诱导。利用该基因序列和水稻基因组数据库相应序列设计引物,扩增到该基因编码区5′上游2050 bp的启动子序列。用PLACE软件分析顺式作用元件,发现该基因起始密码子上游1.4 kb的区域内存在几个可能与该基因表达调控相关的顺式作用元件,如W盒、DOF 结合序列、GT 1、 BIHD1 结合序列等。将该基因启动子区域及其5′部分缺失构件与GUS报告基因相连,并克隆进pCAMBIA1391载体中,用于分析启动子活性及虫伤诱导特异性相关的顺式作用元件。 相似文献
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植物磷脂酶PLDα1与伤害信号转导密切相关,是伤害诱导内源茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成的关键酶之一.橡胶树胶乳PLDα1基因(HbPLDα1)表达的研究将有助于揭示橡胶树乳管细胞JA信号转导及其调控橡胶生物合成的机制.在EST序列的基础上,通过RACE和Genome Walking方法分别克隆了橡胶树胶乳的HbPLDα1基因及其启动子序列.HbPLDα1基因的cDNA全长为2 870 bp,包含长度为2427 bp的完整开放阅读框(ORF),具有典型的植物PLDα蛋白保守功能域,与同属大戟科的蓖麻和麻风树的PLDα1基因亲缘关系最近.HbPLDα1基因启动子区域长为1 559 bp,除含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还存在JA和脱落酸等激素响应元件以及干旱胁迫等环境信号响应元件,这表明HbPLDα1基因的表达可能受激素和环境信号的调控,在橡胶树乳管细胞对激素和环境信号的响应过程中发挥重要作用. 相似文献
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AGL6基因是MADS-box转录因子家族中的一员,是植物特有的转录调控因子,参与花器官形成,对唇瓣的形成起到关键作用。获得铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子,并进行生物信息学分析,对DoAGL6基因启动子进行瞬时表达活性验证,可为进一步研究DoAGL6基因的功能提供参考。本研究克隆DoAGL6基因及其上游的启动子序列,利用在线软件对克隆得到的目的基因序列、启动子序列进行预测,分别构建由全长启动子和5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体并瞬时转化拟南芥及铁皮石斛原球茎,探究其表达活性。结果表明,成功克隆了DoAGL6基因及其启动子,DoAGL6基因编码区长729 bp,编码243个氨基酸,编码蛋白分子式为C1213H1955N359O375S12,预测亚细胞定位于细胞核中;保守结构域分析表明,DoAGL6具有保守的MADS-box和K-box两个结构域,属于MADS基因家族MIKC亚家族。启动子序列长度为1891 bp,顺式作用元件分析结果显示,DoAGL6基因启动子中除了核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还有许多其他顺式作用元件,如脱落酸响应元件（ABRE）、光反应顺式调节元件（G-Box）、茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif）、MADS-box蛋白结合位点（GArG-Box）等。成功构建融合表达载体pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A3-promoter::GUS,拟南芥和铁皮石斛原球茎瞬时转化及GUS组织化学染色结果表明,随着启动子5'端缺失片段的增长,GUS活性逐渐降低,启动子活性逐渐减弱,即全长启动子A1（-1891~1）的活性最强,5'端缺失片段A2（-1488~1）次之,A3（-784~1）活性最弱。瞬时转化后的拟南芥和铁皮石斛原球茎GUS染色均呈现蓝色,但与对照相比均较浅,说明全长启动子和2个5'端缺失启动子都具有驱动GUS的活性,但启动活性都比CaMV35S启动子的启动活性弱。 相似文献
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FCA(Flowering control locus A)基因是自主开花调控途径中的关键调控基因之一,同时,FCA功能具有多样性.本研究中,利用TAIL-PCR方法获得2039 bp橡胶树FCA基因的启动子序列,生物信息学分析发现该启动子中具有28种顺式调控元件,其中主要为基因表达调控核心元件(TAAT-box和CAAT-box)和光响应调控元件.此外,还含有激素、胁迫信号和光周期的顺式作用元件.同时,将橡胶树FCA启动子与GUS基因融合构建植物表达载体转化橡胶树,发现在胚状体、叶片和树根中GUS基因均强烈表达,但在茎段中表达较弱,说明橡胶树FCA基因除参与开花调控外,还可能参与多种发育过程的调控.本研究获得的HbFCA启动子转化橡胶树植株为进一步分析Hb FCA基因功能及表达调控模式提供了遗传材料. 相似文献
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植物磷脂酶PLDα1与伤害信号转导密切相关,是伤害诱导内源茉莉酸（Jasmonic acid, JA）生物合成的关键酶之一。橡胶树胶乳PLDα1基因（HbPLDα1）表达的研究将有助于揭示橡胶树乳管细胞JA信号转导及其调控橡胶生物合成的机制。在EST序列的基础上,通过RACE和Genome Walking方法分别克隆了橡胶树胶乳的HbPLDα1基因及其启动子序列。HbPLDα1基因的cDNA全长为2 870 bp,包含长度为2 427 bp的完整开放阅读框（ORF）,具有典型的植物PLDα蛋白保守功能域,与同属大戟科的蓖麻和麻风树的PLDα1基因亲缘关系最近。HbPLDα1基因启动子区域长为1 559 bp,除含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还存在JA和脱落酸等激素响应元件以及干旱胁迫等环境信号响应元件,这表明HbPLDα1基因的表达可能受激素和环境信号的调控,在橡胶树乳管细胞对激素和环境信号的响应过程中发挥重要作用。 相似文献
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本研究以从刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因，同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体，验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体，并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，经鉴定，转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织，经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织，经PCR鉴定，茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立，验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。 相似文献
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羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 合成酶（HMGS）将乙酰辅酶 A 转化为羟甲基戊二酸单酰辅酶 A,是甲羟戊酸代谢 途径的限速酶之一。本研究从橡胶树热研 879 和热研 7-33-97 品系的胶乳中分离出 HbHMGS1 和 HbHMGS2 基因。相比 HbHMGS1 基因在胶乳和树皮中的共表达模式,胶乳中高丰度表达的 HbHMGS2 基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶合 成的主效基因,而 HbHMGS1 是功能冗余基因。HbHMGS2 基因在橡胶树高产品系热研 879 胶乳中的表达量亦高于测序 品系热研 7-33-97,表明 HbHMGS2 基因的高水平表达可能有助于橡胶的合成。其上游启动子的顺式作用元件差异可能 与该基因在热研 879 和热研 7-33-97 的差异表达有关。HbHMGS2 基因的转录亦受茉莉酸诱导,可能参与了茉莉酸信号 调控天然橡胶的合成过程。HbHMGS2 基因在大肠杆菌中成功表达为后续研究该基因的功能、利用该基因生产活性物质 提供新的基因资源。 相似文献
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从橡胶树叶片转录组数据库中调取花青素合成途径中的关键酶类黄酮3’-羟化酶（F3’H）基因序列信息,通过RT-PCR扩增得到2个橡胶树F3’H基因,分别命名为HbF3’H1和HbF3’H2。通过荧光定量PCR分析发现,只有HbF3’H1基因在不同发育时期的橡胶树叶片和嫩茎中的表达水平与花青素的合成积累趋势完全一致。HbF3’H1所编码的蛋白属于P450超家族,具有保守的F3’H结构域,而且HbF3’H1基因的启动子中包含多种环境效应元件,说明HbF3’H1基因的表达受环境因子调控。通过农杆菌转化烟草发现,过表达HbF3’H1基因的烟草花瓣大量累积花青素,其颜色较非转基因烟草显著加深,同时,荧光定量PCR发现HbF3’H1表达水平与转基因烟草花瓣颜色呈正相关,说明HbF3’H1基因表达促进花青素的累积。本研究为阐明橡胶树花青素代谢途径奠定基础。 相似文献
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应用水稻种子生物反应器开发口服重组胰岛素原具有重要应用前景。通过分子设计保证重组胰岛素原在人体肠道内的自主加工成熟,根据水稻密码子偏爱性人工合成了霍乱毒素β亚基和人胰岛素原的融合基因(cholera toxin B subunit fused with human proinsulin,CTBIN),并在C末端添加内质网滞留信号KDEL。通过PCR技术从粳稻品种日本晴全基因组中克隆谷蛋白启动子及其信号肽序列pGluB1sig(GluB1 promoter and its signal peptide)用于驱动融合基因CTBIN的表达,插入载体pCAMBIA1302,构建了水稻种子蛋白体靶向表达口服重组胰岛素原的载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-Nos。采用农杆菌介导法转化日本晴,获得了46株转基因水稻植株,Western杂交检测到CTB-人胰岛素原融合蛋白在水稻种子中表达。 相似文献
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胶乳被认为是橡胶树的一种与伤害应答相关联的保护物质。割胶可以显著促进橡胶生物合成,且此促进作用与激活乳管细胞中橡胶生物合成相关基因的表达相关,但相关性大小尚不清楚。本文通过qPCR分析了正常割胶条件下,6个橡胶生物合成相关基因HbHRT2、HbSRPP、HbREF、HbHMGR1、HbHRT1、HbGAPDH在5个橡胶树魏克汉种质和5个1981°IRRDB种质胶乳中的表达情况。结果显示：这6个基因在魏克汉种质中的表达水平显著高于1981°IRRDB种质,分别是后者的1.05~14.62、0.97~4.26、1.46~12.56、0.83~2.99、0.43~7.54、1.92~11.31倍,平均值是后者的7.54、2.55、5.69、1.71、2.71、4.91倍。相关性分析表明,这些基因的表达与橡胶树干胶产量呈正相关,其中,HbREF和HbGAPDH的表达水平与干胶产量之间的相关性最高,有望作为橡胶树产量育种的分子指标。 相似文献
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以巴西橡胶树无性系PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79的未开割树为材料,采用荧光定量PCR技术,分析乳管细胞中HMGR1、FDPS、SRPP、REF和HRT2等5个橡胶生物合成关键酶基因的昼夜表达模式。结果表明：5个基因的表达均具有节律性,而且不同基因在同一无性系中以及同一基因在不同无性系间的节律性表达模式都有一定程度的差异。结果为分析不同环境因素对橡胶生物合成相关酶基因节律性表达的影响具有一定参考价值。 相似文献
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实验构建了2个大豆贮藏蛋白Gy1基因种子特异性表达载体,并将其分别转入玉米愈伤组织中。载体1以潮霉素为筛选标记,将Gy1基因片段插入到含有种子特异启动子的植物表达载体pCAMBIA1301-7αP上,得到种子特异性表达载体pCAMBIA1301-7αP-Gy1;载体2以BADH为筛选标记,将Gy1基因插入到带有耐盐基因BADH的植物表达载体pCAMBIA1301-BADH上,得到安全性无抗生素选择标记的种子特异性表达载体pCAMBI-A1301-sbeⅡb-Gy1。通过农杆菌介导法将其分别导入玉米自交系H99的愈伤组织中,共获得132株再生植株;经过PCR检测,初步证明获得了34株转基因阳性植株。 相似文献
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以不同排胶特性的巴西橡胶树 PR107 和 CATAS 8-79 无性系的成龄树为材料，研究强割处理对胶乳中橡胶生 物合成相关生理参数和基因表达的影响。结果表明，强割处理的 PR107 和 CATAS 8-79 品系的胶乳中，HblMYC1 基因 表达量均呈现先上升后降低的模式，且在强割第 3~4 刀时达最大值，后期的 HblMYC1 基因表达量低于初始水平。胶乳 干胶含量的变化趋势与 HblMYC1 基因表达量的趋势一致，而排胶时间、胶乳产量和干胶产量这 3 个生理参数也呈现先 上升后降低的趋势，但在强割的第 5~6 刀时达才到最大值，后期恢复到初始水平。对强割处理胶乳中的各项生理参数 及 HblMYC1 基因表达量进行相关性分析，发现 PR107 品系的胶乳产量、干胶含量与干胶产量三者间均呈极显著正相关， 干胶含量与 HblMYC1 基因表达呈极显著正相关；CATAS 8-79 品系的排胶时间与胶乳产量呈极显著正相关，排胶时间、 胶乳产量、干胶含量三者与干胶产量呈极显著正相关。研究结果表明，在强割条件下的胶乳生理参数和 HblMYC1 基因 表达量之间存在相关性，且能够更快速反映出橡胶树品系的橡胶生物合成特性，为利用分子生物学技术指导制定适宜 的橡胶树割胶制度提供理论依据。 相似文献
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遗传转化率低是转基因技术进一步发展的限制因素。优化玉米转化体系的研究大多以幼胚为受体材料、以GUS基因为报告基因,在一定程度上限制了取材的时间和数量。研究利用携带pCAMBIA1302（含绿色荧光蛋白基因-Green Fluorescent Protein）质粒的 EHA105菌株对玉米自交系H99的愈伤组织进行侵染,借助活体荧光检测技术对GFP基因的瞬时表达进行评价。结果表明,农杆菌侵染液浓度OD600为 0.7～0.8、侵染时间20 min、共培养60 h时,GFP瞬时表达率最高,达到23.47%。 相似文献
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JAR1基因是植物生长素响应基因,具有维持植物体内生长素浓度动态平衡和增强植物抗逆性的功能。为了阐明巴西橡胶树中JAR1基因的结构与功能,本研究利用Q-PCR技术在橡胶树CATAS7-33-97叶片中扩增了JAR1基因,其推导氨基酸含有JAR1蛋白特征性的GH3 superfamily结构域,无信号肽,无跨膜区域,定位在细胞质中,命名为HbJAR1。表达分析结果表明:该基因在橡胶树叶片中的表达量受光照强度、机械伤害和白粉菌侵染显著上调,吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、乙烯利(ET)、脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)对HbJAR1在橡胶树中的表达也起到不同程度的上调作用。表明HbJAR1基因属于植物JAR1家族,与橡胶树对光照、伤害等逆境响应有关。 相似文献