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1.
《南京农业大学学报》2021,44(3)
[目的]Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretion systems, T3SS)在副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)致病过程中发挥重要作用。本试验旨在探讨T3SS1内杆状蛋白基因vscI的功能。[方法]以副溶血弧菌POR-1菌株为研究对象,构建vscI缺失株ΔvscI与回补株CΔvscI,检测野生株、缺失株与回补株的细胞毒性、细胞黏附等生物学特性,分析vscI缺失对副溶血弧菌感染细胞能力的影响;通过Western blot与ELISA检测HeLa细胞内效应蛋白的易位量。[结果]与POR-1菌株相比,缺失菌株ΔvscI在生长速度上并无显著差异,但对HeLa细胞的黏附能力下降85%。细胞毒性检测结果显示:与POR-1菌株相比,缺失株ΔvscI感染细胞组释放LDH量显著下降60%。同时与野生株POR-1感染HeLa细胞组相比,ΔvscI感染HeLa细胞组发生凋亡的细胞数量显著下降了85%。腺苷酸环化酶报告系统研究结果显示:与POR-1菌株感染组相比,ΔvscI菌株感染HeLa细胞内的cAMP含量显著下降,CyaA融合蛋白的易位量显著下降,而在回补株CΔvscI中上述生物性状均恢复。[结论]vscI提高了副溶血弧菌对细胞的黏附能力和毒力,促进细胞凋亡,同时对于T3SS1效应子的易位是必需的。 相似文献
2.
[目的]外膜蛋白Omp A是一个多功能蛋白,在很多革兰氏阴性菌的环境适应性和致病性过程中发挥重要作用,而副溶血弧菌Omp A的功能尚未见报道。本试验旨在研究omp A基因(VPA1186)对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响。[方法]通过构建副溶血弧菌SH112株的omp A基因缺失株和互补株,开展对该基因在细菌生长特性、生物被膜形成、运动性、血清杀菌、细胞黏附、细胞毒性,组织载量以及小鼠致病性等相关生物学特性和致病性的影响研究。[结果]omp A的缺失不影响副溶血弧菌的生长速度、生物被膜形成能力和运动性。野生株和Δomp A的黏附和抗血清试验结果无显著差异。但Δomp A对Caco-2细胞的毒性作用显著低于野生株。小鼠染毒验结果显示,与感染野生株的小鼠相比,感染Δomp A的小鼠症状明显减轻,存活率更高,Δomp A在小鼠血液和肝脏中的带菌量显著低于野生株,而互补株的毒力恢复至野生株水平,表明omp A缺失能显著降低副溶血弧菌的毒力。[结论]omp A与副溶血弧菌的致病性相关,为潜在的毒力因子。 相似文献
3.
为探究嗜水气单胞菌双组分系统的调控功能,通过同源重组法敲除嗜水气单胞菌双组分基因envZ/ompR,检测各菌株在不同盐浓度胁迫条件下的生长情况,采用结晶紫染色法比较各菌株的生物被膜形成能力,通过全血共培养试验评估各菌株抵御鱼血杀伤的能力;比较不同菌株感染斑马鱼的半数致死量（LD50）,通过草鱼组织载菌量评判各菌株的侵袭能力,采用荧光定量PCR检测各脏器的促炎因子的转录水平。结果显示,在不同盐度条件下嗜水气单胞菌双基因缺失株ΔenvZ/ompR的生长没有显著差异,而其下游基因ompF和ompC的转录水平显著受到影响;ΔenvZ/ompR株的生物被膜形成能力以及抗鱼全血杀伤能力相较野生型都显著下降。ΔenvZ/ompR的斑马鱼刮伤感染LD50较野生型增长了4.8倍,致病力减弱,在草鱼腹腔感染中其全身扩散能力也较野生株显著减弱,并且ΔenvZ/ompR感染组草鱼脾脏、肝脏和肾脏中促炎因子TNF-α和IL-6的转录水平相对于野生株感染组均显著降低。上述结果表明嗜水气单胞菌双组分系统EnvZ/OmpR参与响应渗透胁迫,参与调控生物被膜形成,且在致病过程尤其是在宿主体内系统扩散过程中发挥重要作用。 相似文献
4.
为明确双组分系统FlrBC在嗜水气单胞菌极生鞭毛合成、生物被膜形成及致病机制中的作用,通过同源重组法,以嗜水气单胞菌ZYAH72为野生菌株构建双组分系统FlrBC缺失株ΔflrB和ΔflrC,比较不同菌株鞭毛合成及游动性、生物被膜形成、胞外多糖分泌、细胞黏附以及抗全血杀伤能力差异。结果显示:与野生株相比,ΔflrB和ΔflrC仍能形成极生鞭毛,细菌游动能力无显著差异;而结晶紫染色发现ΔflrB和ΔflrC相较于野生株的生物被膜形成能力分别下降了27.2%和22.3%;刚果红检测结果显示,与野生株相比,ΔflrB和ΔflrC的胞外多糖分泌分别下降了18.4%和14.2%;实时荧光定量PCR的结果显示,flrB和flrC的缺失不同程度抑制了鞭毛合成、生物被膜相关通路基因的表达;与草鱼肾细胞共孵育后,ΔflrB和ΔflrC的细胞黏附率与野生株相比分别下降了23.2%和18.2%;全血杀伤实验结果显示,ΔflrB和ΔflrC抗全血杀伤能力均显著减弱。以上结果表明,双组分系统FlrBC不是嗜水气单胞菌极生鞭毛形成所必需,但在细菌鞭毛形成组装和生物被膜形成中发挥调控作用,并且影响嗜水气单胞菌致病性... 相似文献
5.
《南京农业大学学报》2020,(3)
[目的]本文旨在研究前噬菌体phiv205-3片段对禽致病性大肠杆菌DE205B氧化应激耐受力的影响。[方法]利用Red同源重组技术敲除前噬菌体phiv205-3片段,构建前噬菌体片段缺失株DE205BΔphiv205-3,检测野生株和前噬菌体片段缺失株对氧化应激的耐受力;进一步敲除前噬菌体片段中氧化应激耐受相关基因nrdE、nrdF、nrdH、nrdI,构建前噬菌体基因缺失株DE205BΔnrdE、DE205BΔnrdF、DE205BΔnrdH和DE205BΔnrdI,并通过基因序列分析和荧光定量PCR(qPCR)检测这些缺失菌株和野生菌株的氧化应激耐受力。[结果]与野生株相比,前噬菌体片段缺失株DE205BΔphiv205-3氧化应激耐受力下降33%(P0.05);qPCR检测结果显示,前噬菌体基因nrdF在氧化应激情况下转录水平显著提高(P0.05);对构建前噬菌体单基因缺失株检测结果显示:与野生株相比,缺失株DE205BΔnrdF在氧化应激环境下的存活率下降21%(P0.05),而缺失株DE205BΔnrdE、DE205BΔnrdH和DE205BΔnrdI的存活率无显著变化。[结论]前噬菌体片段编码的nrdF基因有助于增强宿主细菌DE205B氧化应激耐受力。 相似文献
6.
《南京农业大学学报》2021,44(5)
[目的]本文旨在研究碳酸酐酶(SCA)对猪链球菌生长及抗氧化应激的影响,并分析其生物学功能。[方法]以猪链球菌2型野生株SC070731为背景,构建sca缺失株Δsca,通过测定不同条件下的生长曲线和H_2O_2应激、小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬与存活、猪全血存活等试验,评价SCA对猪链球菌生长及抗氧化应激的影响。[结果]与野生株相比,Δsca株在缺乏CO_2条件下的生长受到显著抑制,生长12 h A_(600)值低于0.5;在5%CO_2条件下,虽然Δsca株的迟缓期较野生株长,但平台期其恢复到与野生株相同的水平,A_(600)值均接近1.6;在缺乏CO_2条件下,添加NaHCO_3可显著刺激Δsca株生长,且与浓度呈正相关;添加不饱和脂肪酸(UFA)油酸或Tween-80、Tween-20等UFA衍生物均可显著促进Δsca株生长。经H_2O_2作用20 min后,野生株存活率为99.48%,而Δsca株存活率为74.04%(P0.01)。吞噬试验表明,RAW264.7对野生株和Δsca株的吞噬率无显著差异;存活试验表明,经抗生素处理3 h后,野生株的存活率为77.98%,而Δsca株在RAW264.7内的存活率显著降低,仅为38.93%(P0.01)。猪全血存活试验表明,与野生株的存活率(110.02%)相比,Δsca株在猪全血中的存活率为51.39%(P0.01)。[结论]SCA促进猪链球菌利用CO_2和HCO~-_3,并参与UFA合成,因而有助于猪链球菌的生长及抗氧化应激;该酶促进猪链球菌在猪全血和小鼠巨噬细胞中存活,提示其在猪链球菌致病过程中发挥重要作用。 相似文献
7.
[目的]分离并鉴定鸭源新城疫病毒。[方法]从安徽地区鸭病料中分离新城疫病毒,测定其鸡胚半数感染量(EID_(50))、鸡胚平均致死时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)。[结果]2株新城疫病毒均为强毒。通过RT-PCR技术对这2株鸭新城疫病毒的F基因进行序列测定与分析,结果发现F基因裂解位点为~(112)RRQKRF~(117),符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列。F基因遗传进化树分析发现,AH1株属于基因Ⅶ型,而AH2株属于基因Ⅵ型,来源于鸽源病毒。[结论]水禽新城疫病毒(NDV)的感染来源复杂,应避免将不同种类的家禽混合饲养。 相似文献
8.
[目的]发掘植物海藻糖合成途径关键酶基因,探究其编码蛋白TPS活性,为作物遗传改良抗多种胁迫提供优良的候选基因。[方法]本研究基于干旱条件下从甘薯转录组数据库中得到一条与拟南芥AtTPS1基因高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR技术克隆了甘薯TPS基因。利用生物信息学软件分析序列特征,酵母互补试验鉴定编码蛋白TPS活性。[结果]IbTPS1基因cDNA序列全长2 811bp,编码936个氨基酸,且具有典型的GT1-TPS和HAD-TPP结构域;生物信息学预测表明IbTPS1编码的蛋白是一个不稳定亲水性蛋白,无信号肽,定位于细胞质中;二级结构元件多以无规则卷曲和α-螺旋为主;酵母互补实验证明表达IbTPS1基因的TPS突变酵母菌株(tps1Δ)和TPS,TPP双突变酵母菌株(tps1Δtps2Δ),以葡萄糖为唯一碳源的尿嘧啶缺失培养基上可恢复生长。[结论]证实甘薯IbTPS1基因的编码蛋白具有生物活性。 相似文献
9.
鳗源嗜水气单胞菌L316主要外膜蛋白基因克隆和序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表嗜水气单胞菌（AH）的外膜蛋白基因（Omp）的核苷酸序列设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增AHL316的主要外膜蛋白基因（Momp）,经T/A克隆,插入到pGEM-T系列载体上进行序列测定,结果表明Momp基因最长的开放阅读框（ORF）为1 035 nt,编码由分子量为36 kD的主要外膜蛋白（MOMP）,其与国外AH分离株AF146597的Omp基因的核苷酸的同源性达96%,氨基酸的同源性达98%.应用分子生物学软件分析表明此主要外膜蛋白前24个氨基酸是较强的疏水性区域,可形成信号肽,有跨膜区,经与其他外膜蛋白系统发育进化分析表明,该蛋白属于ompA蛋白家族. 相似文献
10.
[目的]研究基因prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin对干酪乳杆菌体内外黏附性的影响。[方法]利用荧光标记技术对干酪乳杆菌亲本株(L.c)及prtP基因缺失突变株(L.cΔprtP)进行标记,对6~8周龄的BALB/c小鼠进行干预,测定亲本株和突变株体内黏附菌体数量的差异,同时测定其在体外对小鼠肠黏液的黏附性。[结果]L.cΔprtP的黏附率总体上较L.c低,黏附能力较L.c弱。说明干酪乳杆菌的黏附性受lactocepin的影响很大。[结论]干酪乳杆菌体内外黏附性与基因prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin有关。 相似文献
11.
《中国农业科学》2010,(1)
【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xooc)的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因编码形成的Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS),将致病性效应分子注入水稻细胞中,但Xooc的hrcJ基因在致病性中的作用以及其如何参与形成T3SS分泌装置,并不明确。【方法】本研究根据标记交换原理对Xooc的hrcJ基因进行了敲除。【结果】发现hrcJ突变体丧失在水稻上的致病性和在烟草上的HR激发能力。酵母双杂交显示,HrcJ蛋白N端脂蛋白结构域可与HrcC互作,HrcJ蛋白C端跨膜结构域可与HrcV互作,提示HrcJ蛋白联接于T3SS装置的内膜和外膜之间。功能互补结果显示,缺失脂蛋白结构域和跨膜结构域的hrcJ基因均不能恢复hrcJ突变体在烟草上的HR激发能力和在水稻上的致病性。RT-PCR结果显示,hrcJ的表达受hrpX基因调控,hrcJ基因突变后不影响效应分子hpa1的表达。【结论】hrcJ基因是水稻条斑病菌致病性和非寄主上激发HR的关键因子,其基因产物参与了T3SS装置的形成。 相似文献
12.
水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究水稻白叶枯病菌fkb M基因对其运动性的影响。[方法]采用同源置换方法对水稻白叶枯病菌野生型菌株PXO99A的fkbM基因进行基因敲除,构建突变菌株ΔfkbM_(Xoo),同时构建互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)。通过运动性试验,确定fkbM基因对运动性的影响。[结果]与野生型菌株PXO99~A相比,ΔfkbM_(Xoo)突变体运动性明显减弱,而互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)能基本恢复水稻白叶枯病菌的运动性。[结论]水稻白叶枯病菌fkbM基因突变能减弱水稻白叶枯病菌的运动能力。 相似文献
13.
[目的]研究沙门氏菌效应蛋白SopB中跨膜疏水结构域288-309肽段对受SopB诱导的HeLa细胞Akt磷酸化激活中的功能。[方法]通过重叠延伸PCR的方法构建SopB第288~309位肽段缺失突变基因,并将该基因在HeLa细胞中进行异位表达,与野生型SopB基因进行比较,确定缺失的第288~309位间肽段在受SopB诱导的Akt磷酸化激活中的作用。[结果]与空载体对照相比较,在HeLa细胞中表达野生型SopB重组质粒明显激活了pAkt473的磷酸化,而在HeLa细胞中表达SopB缺失突变体SopBΔ288-309时,则检测不到pAkt473的磷酸化激活。[结论]SopB表达激活HeLa细胞pAkt473的磷酸化与其第288~309位肽段的功能直接相关,该跨膜疏水结构域的缺失导致SopB蛋白不能亚细胞定位至细胞膜,从而导致SopBΔ288-309对pAkt473磷酸化激活功能的丧失。 相似文献
14.
[目的]考察迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)EIB202中大质粒pEIB202在其致病过程中的作用,将质粒pEIB202消除,为开发抗迟钝爱德华氏菌病的安全减毒的活疫苗打下良好基础。[方法]采用同源重组技术以sacB为反向筛选标记消除质粒。[结果]对质粒pEIB202进行序列分析,发现该质粒编码多种抗性基因及部分Ⅵ型分泌系统(T4SS)组分,说明该质粒可能与E.tarda的多重耐药性及致病力相关。质粒消除菌株EIB202Δp丧失氯霉素及四环素抗性,在生长、毒力、胞外蛋白分泌等方面与野生株无显著差异。[结论]pEIB202质粒是造成EIB202多重耐药性的主要原因,在其致病过程中可能并不起直接作用。 相似文献
15.
[目的]本文旨在研究荚膜聚合酶Wzy对猪链球菌Chz型致病力的影响。[方法]通过基因组可视化软件(ACT)和比较基因组学方法,探究猪链球菌荚膜(CPS)基因簇的遗传多样性;构建cpsB及wzy基因缺失株,利用透射电子显微镜(TEM)研究Wzy与荚膜合成的关系;采用细胞试验及动物试验等验证荚膜聚合酶Wzy对细菌致病力的影响。[结果]与野生株相比,wzy基因缺失株荚膜样物质减少并展现出更强的生物被膜形成能力。细胞试验显示,缺失株具有更强的小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3)黏附能力和侵袭能力,但对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的吞噬作用更敏感。BALB/c小鼠攻毒试验结果表明,缺失株的致病力显著减弱,在小鼠体内的定殖和扩散能力也明显下降。[结论]荚膜聚合酶Wzy降低猪链球菌的致病力。 相似文献
16.
HrcJ参与了Ⅲ型分泌装置的形成从而决定条斑病菌在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xooc）的hrp（hypersensitive response and pathogenicity）基因编码形成的Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）,将致病性效应分子注入水稻细胞中,但Xooc的hrcJ基因在致病性中的作用以及其如何参与形成T3SS分泌装置,并不明确。【方法】本研究根据标记交换原理对Xooc的hrcJ基因进行了敲除。【结果】发现hrcJ突变体丧失在水稻上的致病性和在烟草上的HR激发能力。酵母双杂交显示,HrcJ蛋白N端脂蛋白结构域可与HrcC互作,HrcJ蛋白C端跨膜结构域可与HrcV互作,提示HrcJ蛋白联接于T3SS装置的内膜和外膜之间。功能互补结果显示,缺失脂蛋白结构域和跨膜结构域的hrcJ基因均不能恢复hrcJ突变体在烟草上的HR激发能力和在水稻上的致病性。RT-PCR结果显示,hrcJ的表达受hrpX基因调控,hrcJ基因突变后不影响效应分子hpa1的表达。【结论】hrcJ基因是水稻条斑病菌致病性和非寄主上激发HR的关键因子,其基因产物参与了T3SS装置的形成。 相似文献
17.
以Rab2作为诱饵钓取布鲁菌效应蛋白,通过RT-PCR获得鼠Rab2基因,利用基因克隆方法构建表达载体pGEX-4T-1-Rab2及其2个突变体pGEX-4T-1-Rab2[N119I]和pGEX-4T-1-Rab2[Q65L];然后IPTG诱导GST-Rab2、GST-Rab2[N119I]和GST-Rab2[Q65L]融合蛋白的表达,使用琼脂糖亲和介质分离纯化融合蛋白;最后将纯化的融合蛋白与超声破碎的野生布鲁菌或Δvirb2缺失布鲁菌株上清互作,利用SDS-PAGE电泳和银染确定差异蛋白,质谱分析差异蛋白。结果表明:所鉴定出的布鲁菌株效应蛋白为热休克蛋白HSP70。这为未来研究HSP70如何调节布鲁菌胞内寄生奠定基础。 相似文献
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PFOS对斑马鱼的急性毒性及安全浓度评价 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]探讨全氟辛烷磺酸(PFOS)对斑马鱼的生态毒性效应。[方法]采用静态染毒法研究不同浓度的PFOS暴露对斑马鱼的急性毒性效应。[结果]不同浓度PFOS暴露条件下斑马鱼出现鱼体侧翻、失去平衡、游泳能力和和呼吸能力减弱等中毒现象,随着PFOS暴露浓度的增加和暴露时间的延长,斑马鱼的死亡率也相应增加,存在明显的剂量效应和时间效应关系。PFOS对斑马鱼24、48、72、96 h的半致死浓度(LC_(50))分别为26.09、9.08、3.91和2.58 mg/L,安全浓度为0.258 mg/L。根据急性毒性分级标准,判断PFOS对斑马鱼的毒性为高毒。[结论]该研究结果可为掌握PFOS的生态毒性以及评价其生态风险和危害提供科学依据。 相似文献
19.
《南京农业大学学报》2018,(6)
[目的]构建尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC) CFT073株的双组分信号系统Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因的缺失株,并研究基因缺失株在有氧和厌氧条件下的生长特性。[方法]运用Red重组系统将带有c5032—c5037基因同源臂的氯霉素抗性基因取代c5032—c5037基因,在温度敏感型质粒p CP20作用下消除氯霉素抗性基因,构建基因缺失株CFT073Δc5032—c5037,用PCR和基因测序验证基因敲除是否成功,测定有氧和厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中培养不同时间的菌液D600值。[结果]构建了CFT073Δc5032—c5037,PCR验证及基因测序结果均表明已成功敲除c5032—c5037基因;厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中生长比野生型菌株CFT073缓慢,且差异极显著(P0.01),但在有氧条件下二者的生长无显著差异。[结论]成功构建了基因缺失株CFT073Δc5032—c5037,并试验证实Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因在厌氧条件下参与α-酮戊二酸的利用,为进一步研究Kgu S/KguR在UPEC中的代谢适应机制奠定了基础。 相似文献
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为探索clpP基因对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,P.c.c)生物学特性及致病性等方面的影响,采用同源重组法构建clpP基因缺失突变体ΔclpP和互补菌株ΔclpP(clpP),测定突变体及互补菌株的运动性、生物膜、抗氧化压力,以及在不同培养基和不同温度下的生长能力、部分致病因子活性及致病性等表型,并采用RT-PCR分析了果胶酸裂解酶(Pel)、纤维素酶(Cel)、蛋白酶(Prt)和坏死诱导蛋白(necrosis-inducing protein,Nip)等相关致病因子的编码基因转录水平变化。结果表明:ΔclpP的运动性无变化,生物膜形成、高温和营养饥渴耐受力及抗氧化压力等均下降;果胶酶、纤维素酶与蛋白酶活性有不同程度降低,酶活性检测平板上水解圈的直径分别比野生株下降19.35%、34.38%和35.00%;ΔclpP的致病性显著下降,离体接种‘黄花马蹄莲’叶片和大白菜叶柄,病斑面积分别比野生株的减小99.00%和99.60%;在4个毒力因子中,qRT-PCR显示:ΔclpP果胶酸裂解酶与纤维素酶mRNA相对表达量为野生菌株的40.00%左右。由此可见,clpP基因对胡萝卜软腐果胶杆菌的生长和致病性具有多方面的决定作用。 相似文献