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1.
出于对转基因作物中标记基因的安全性考虑,植物转基因育种中标记基因的删除将成为未来研究的热点之一。位点特异性重组系统之一Cre／loxP系统是目前在植物遗传转化中应用较多,较成熟的一个标记基因删除系统。为了利用Cre／loxP系统构建一种可调控的标记基因删除系统,本研究首先从拟南芥中克隆了逆境诱导型的启动子rd29A,同时从质粒pCre上克隆了Cre基因,构建了含有rd29A：Cre：Tnos表达元件的中间载体,将这一表达元件插入到另一植物双元表达载体pKsb中,最终构建了含有loxP-Pnos—nptⅡ-Toes—rd29A—Cre-Tnos-loxP的可诱导型删除标记基因nptⅡ的植物双元表达载体。 相似文献
2.
筛选标记基因在转基因植物应用中存在一定潜在安全风险,在转基因植物改良中如何合理消除该基因非常必要。转录因子PTF1具有改善植物在低磷胁迫下吸收磷效率的作用。本研究用根癌农杆菌介导法将Cre/loxPGmPTF1导入大豆品种豫豆22,利用β-雌二醇诱导Cre/loxP系统删除筛选标记基因,获得了无筛选标记的转GmPTF1基因大豆。用PCR法扩增删除标记基因后的重组序列并测序显示,筛选标记基因在大豆基因组中已经被完全删除,重组序列中目的基因序列正确并保持了正确开放读码框;loxP位点重组出现一种新的拼接类型,重组后2个loxP序列全部缺失,新重组拼接位点长38 bp,与NCBI数据库的其他序列均无同源性,并且重组涉及2个loxP位点的外侧翼序列,造成Cre/loxP盒上游loxP和下游loxP外侧翼序列部分缺失。经过RT-PCR和Western杂交验证显示无筛选标记转基因大豆植株中GmPTF1能够正常转录和翻译,在根系、叶片及茎中的GmPTF1蛋白表达量均高于野生型对照,而在种子中与对照无显著差异。沙培试验表明,在低磷条件下无筛选标记转基因大豆苗期根系指标、生物干重、叶绿素含量和磷含量均显著高于野生型对照,而丙二醛含量低于对照。利用Cre/loxP重组系统可以有效删除转基因大豆中的筛选标记基因。 相似文献
3.
在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物遗传转化中,常常需要用到植物表达双元载体。为便于基因工程操作并能在获得转基因植物后方便将标记基因删除,我们构建了植物表达双元载体pYBA100,以满足用于生产安全转基因植物的需要。本研究通过融合PCR方法,尽可能去除所有非必需的序列,将pYBA载体最小化。pYBA载体在大肠杆菌中为多拷贝,骨架为3.69kb。我们构建的含NptⅡ植物筛选标记基因的载体pYBA100仅为5.37kb,多克隆位点为22个,方便基因工程操作。载体pYBA100的T-DNA植物筛选基因表达框两侧预留有LoxP-FRT融合位点,方便在获得转基因植物后通过Cre或FLP重组酶将植物筛选标记基因删除。pYBA100载体能于大肠杆菌和农杆菌中自我复制,并成功转化了拟南芥,符合农杆菌介导的植物转基因要求。离体删除实验结果证明,载体pYBA100能经Cre重组酶删除植物标记基因表达框。 相似文献
4.
猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在转基因玉米中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究拟构建携带猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白基因(TGEV-S)的转基因玉米植株并检测其表达情况。首先利用PCR方法自携带TGEV-S基因的重组质粒中扩增2.2kb的S基因片段,然后插入植物表达载体pBAC176中,该表达载体以编码除草剂草甘膦抗性的EPSP基因作为选择标记,目的基因以双增强子的CaMV35S(E35S)及其玉米Hsp70第一内含子为驱动。以授粉后10～12d约0.5～1mm大小的玉米幼胚为受体,用基因枪进行转化,经过愈伤组织诱导、草甘膦抗性筛选和分化再生培养,先后获得74株转化再生植株。利用PCR和Southern blot检测表明,T0代转基因苗有9株检测结果为阳性。T1代转基因玉米株系经PCR检测有14个转基因株系为阳性,初步确定了目的基因在这些转基因玉米中的稳定整合。进而通过间接ELISA分析初步确定目的基因在7个T1代转基因玉米株系获得了表达。研究结果为进一步研究表达TGEV-S转基因玉米的生物学活性奠定了基础。 相似文献
5.
Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。 相似文献
6.
转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。 相似文献
7.
虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，具有广泛的应用价值。β-胡萝卜素酮化酶（Bkt）是由玉米黄素合成虾青素生物合成途径中的关键酶。采用La Taq DNA聚合酶用PCR的方法从pET-28a（+）bkt中扩增得到bkt基因，用bkt基因替换pBI221中的GUS基因形成含有CaMV 35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒，然后插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点，最终获得带有选择标记和报告基因的植物表达载体pCAMBIA1301-bkt。通过农杆菌LBA4404介导将其转化进入玉米自交系齐319，转化后的愈伤经GUS组织化学染色分析表明bkt基因已经转入玉米胚性愈伤组织 相似文献
8.
利用正义RNAi技术提高玉米直链淀粉含量效果的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
为了研究利用正义RNAi技术提高玉米直链淀粉含量效果,用基因枪法将构建的sbeⅡb正义RNAi表达载体pBAC506和pBAC508(筛选标记基因分别为35S启动子及Adh1-intron1增强驱动的epsps和bar)导入玉米(Zea mays)自交系幼胚愈伤组织,经过筛选、分化和再生获得了44株转基因当代植株,经PCR扩增、PCR-Southern检测有30株为阳性.选择9株健壮的阳性植株进行基因组Southern-blotting分析,结果表明7株T0植株整合了目的基因,其中4株整合了1个转基因拷贝,2株整合了2个转基因拷贝,1株整合了3个转基因拷贝.这7株中有2株结实,直链淀粉含量分别为23.22%和24.60%,有一定的小幅提高.下一步要进行较大规模的基因枪转化,得到比较大的转基因群体,以对更多转基因后代进行鉴定,期望筛选出外源基因多拷贝插入和直链淀粉含量大幅提高的株系. 相似文献
9.
LFY基因是从从野生型拟南芥中克隆出的一个与调控花分生组织启动相关的基因,它有促进植物提早开花的作用。用PCR方法从克隆载体上扩增出LFY基因并在两端添加XhoⅠ酶切位点,将其连接在用XhoⅠ切除了hyg基因的pCAMBIA1301表达载体上,得到去除选择标记的LFY基因植物表达载pCAM-BIA1301-LFY。质粒pCAMBIA1301经HindⅡ/EcoRⅠ双酶切补平自连后得到去除多克隆位点的质粒pCAMBIA1301-,再经SacII/SphI双酶切后插入到经SacⅡ酶切的pCAMBIA1301-LFY中。建成双T-DNA植物表达载体pCAMBIA1301-LFY-hyg-,经酶切鉴定证明了所构建载体的正确性。将此双T-DNA载体用农杆菌介导法转化菊花叶片,期望得到无选择标记含LFY基因的转基因菊花。 相似文献
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转外源法呢基焦磷酸合酶基因烟草抗赤星病研究 总被引：4，自引：0，他引：4
将已克隆的薄荷（Mentha spicata L.）法呢基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase, fps）的cDNA插入载体,构建CaMV35S启动子驱动下的植物表达载体pBinARfps。用捕获该质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404与烟草叶片外植体共培养,并在附加30 mg/L Kan的MS＋0.1 mg/L IAA＋1.5 mg/L BA培养基上诱导植株分化,再生芽在附加30 mg/L Kan的MS培养基上生根,再生植株。Kan阳性植株经PCR-Southern检测筛选,得到5株PCR阳性植株（K-4,K-6,K-17,K-19,K-35）,证明外源fps基因在烟草基因组中的整合;Northern blot检测证明外源fps基因在转录水平进行了表达;离体叶片接种实验表明,转基因植株（T1代）对赤星病抗性明显提高。这表明fps基因在植物抗病基因工程中具有潜在应用价值。 相似文献
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Aflatoxins are carcinogenic and toxic metabolites produced by the fungus Aspergillus flavus during infection of maize (Zea mays L.) and other seed oil crops. Climatic conditions in the southeastern United States favor A. flavus infection and aflatoxin contamination in maize, making it a major issue for farmers in the region. One of the most promising avenues to combat aflatoxin contamination is the development of resistant maize lines. However, this has proven difficult due to a lack of reliable markers for resistance. Previous studies have identified candidate genes that were differentially expressed in response to A. flavus infection. One gene, encoding a chloroplast precursor, was found to contain multiple polymorphisms that were used to design a marker designated Mississippi Marker 1 (MpM1). The marker differentiates between the “resistance” and “susceptible” forms of the allele. This marker was used to screen three populations of F2:3 mapping families, where it was found to map to chromosome 4 and was associated with a significant effect for resistance to aflatoxin accumulation in the Mp313E × B73 mapping population. Furthermore, the marker MpM1 identified a previously unknown quantitative trait loci for resistance to aflatoxin accumulation on maize chromosome 4. MpM1 is the first gene-based marker developed specifically for resistance to aflatoxin accumulation in maize and can now be integrated into existing marker assisted selection programs aimed at incorporating resistance into elite maize breeding lines. 相似文献
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反义外壳蛋白基因介导的抗SCMV转基因玉米研究 总被引：6，自引：1，他引：6
玉米矮花叶病（MDM）是一种世界性病害，在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)所致。为探索一条高效、安全的抗SCMV转基因途径，构建了无标记基因的SCMV反义外壳蛋白基因（cp）表达载体pACP。通过冻融法将该载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农杆菌LBA4404,然后共转化玉米自交系综3的幼胚。通过除草剂梯度筛选，从抗性愈伤组织分化获得了35株再生苗。PCR检测证明，其中26株带有抗除草剂标记基因（bar），14株带有SCMV反义cp基因。这14株带有目的基因的玉米植株自交，其种子在田间种植成株行（T1代）。玉米T1代幼苗人工接种SCMV，筛选出2个抗病株率高于70%的株行。ELISA检测表明，抗病株SCMV含量极低，抗性达高抗水平。PCR检测表明，抗病性是反义cp基因作用的结果，并且获得了2株cp基因阳性而标记基因阴性的抗病株。 相似文献
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将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。 相似文献
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为了获得小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体,以小麦品种‘京花1号’开花12天的籽粒为材料,用天根公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,以wx-B1a基因(GenBank NO:AB019623)的cDNA序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR克隆了wx-B1a基因部分cDNA片段。Blastn结果显示,它与GenBank上报道的Triticum aestivum wx-1 gene(GenBank NO:EU719611.1)同源。通过酶切连接将此片段分别置于拟南芥FAD2的Intron1(GenBank NO:AJ271841)的上、下游,然后将此发夹结构置于小麦HMW-GS 1Dx5启动子的下游,从而构建了小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体pBAC47p-wx-B1aIR。从而为下一步转化高产强筋小麦品种培育优质面条专用小麦奠定基础。 相似文献
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Op IAP(Orgyia pseudotsugata inhibitor of apoptosis protein)是黄杉毒蛾核型多角体病毒中编码细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)的基因,p35基因编码苜蓿斜纹夜蛾核型多角体病毒中具细胞凋亡抑制作用的35 k Da蛋白。本研究人工合成了Op IAP和p35基因,构建了同时含有Op IAP和p35表达盒的转双价基因载体p Ubi:p35-RSS1P:Myc-Op IAP,两基因分别由玉米泛素基因启动子(Ubiquitin,Ubi)和水稻蔗糖合酶-1启动子(sucrose synthase-1 promoter,RSS1P)驱动。通过基因枪介导法将该载体导入小麦品种扬麦16,获得双价转基因小麦。对T0~T2代植株,利用PCR、RT-PCR、q RT-PCR及Western blot分析,确认导入的外源Op IAP和p35基因能够在4个转双价基因小麦株系中遗传并表达。用来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌强致病株型R0301和WK207对转双价基因小麦的T1、T2代植株分别进行纹枯病抗性鉴定,结果表明,与受体扬麦16相比,双价转基因小麦的T1、T2代植株对纹枯病的抗性明显提高,说明Op IAP和p35基因的表达可以增强转基因小麦对来源不同、致病力不同的禾谷丝核菌的抗性。 相似文献
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Pti基因不但在植物的抗病信号传导中起着非常重要的作用,而且玉米中一个类Pti1基因——ZmPti1还参与了植物抗盐的信号传递。为了研究ZmPti1 在植物体内亚细胞水平上的分布情况,利用绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,分别构建了以35S 为启动子表达ZmPti1-GFP 融合蛋白和GFP游离蛋白的植物表达载体pGreen0029-35S∷ZmPti1-GFP 和pGreen0029-35S∷GFP, 通过花浸蘸法转入拟南芥中进行过量表达。在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmPti1在植物细胞中的定位。研究结果表明: ZmPti1是一个可溶性蛋白,定位在细胞质内。 相似文献
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抗逆调节转录因子CBF1基因提高多年生黑麦草的抗旱能力 总被引：16，自引：0，他引：16
通过逆境诱导型启动子rd29B为驱动,分别构建出含有抗逆调节转录因子CBF1基因的表达载体pBAC122,pBAC127,其中pBAC127以CaMV35S启动子驱动的bar基因作为选择标记。用高压氦气基因枪PDS1000/He分别将表达载体导入多年生黑麦草(Lolium perenne)品种Topgun的幼胚、成熟胚和愈伤组织。经除草剂Bialaphos抗性筛选和植株再生,获得了36棵转基因植株。经PCR,Dot-blotting的分子检测,CBF1基因已整合到多年生黑麦草部分转基因株系的基因组中。用5种不同浓度的除草剂涂抹黑麦草叶片,非转基因植株表现为不抗,而转基因植株最高可以抗到135~200 mg/L。叶片脯氨酸含量测定表明,经干旱处理或使用15%PEG处理,转基因植株叶片脯氨酸含量比未处理时显著提高,部分转基因植株提高幅度明显高于非转基因植株。经过25 d人工温室干旱处理,有3棵植株显示出存活迹象,复水后,有1棵植株(C122-7)恢复正常生长。从而表明,利用逆境诱导型启动子(rd29B)来调控外源CBF1基因的表达,能显著改良黑麦草的抗旱能力。 相似文献