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《中国畜禽种业》2021,(5)
为了对牛病毒性腹泻病毒(BVDV) p7蛋白进行表达和纯化,本研究开展p7基因克隆、原核表达载体构建和原核表达分析。依据GenBank数据库中BVDV毒株NADL的p7基因设计引物,以BVDV NADL的cDNA为模版,PCR扩增p7基因,测序鉴定后将其克隆至pCold-MBP原核表达载体中;优化蛋白诱导的IPTG浓度,过夜低温诱导p7蛋白表达,并使用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化。结果显示,成功克隆p7基因,与GenBank数据库中p7基因同源性100%;成功构建pCold-MBP-p7载体;IPTG浓度为1.2mM时诱导效果最佳;成功表达和纯化MBP-p7融合蛋白。结论:诱导表达纯化获得MBP-p7融合蛋白,为后续构建p7蛋白的多克隆和单克隆抗体提供重要的材料和平台。 相似文献
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为获得具有活性的A型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白,以重组质粒pUC57-MM-VP1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV VP1基因片段,并将该片段插入原核表达载体pET-28a构建重组质粒pET-28a-MM-VP1;之后将该质粒转入E.coli BL21(DE3)进行诱导,同时对诱导温度进行了优化。SDSPAGE显示,最佳诱导温度为18℃,VP1蛋白主要以包涵体形式高效表达;为了提高VP1蛋白可溶性表达,将重组质粒pET-28a-MM-VP1与pTF16共同转入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,并对表达条件进行优化。结果表明,分子伴侣有效提高了A-VP1重组蛋白的可溶性表达量,诱导最佳条件为18℃、0.1 mmol·L~(-1)IPTG、2 g·L~(-1)阿拉伯糖、诱导时间20 h。Western-Blot结果表明,得到的重组蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,反应原性良好。 相似文献
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《山西农业大学学报(自然科学版)》2016,(6)
为克隆玉米(Zea mays L.)磷酸丙糖异构酶基因ZmTPI,并进行序列分析和原核表达研究,根据玉米TPI基因的cDNA全长序列设计特异引物,以玉米叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到了约750bp的基因编码区cDNA片段,T/A克隆后进行了序列测定及序列分析,随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX-4T-1上,得到的重组表达质粒GST-ZmTPI转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。结果显示,玉米ZmTPI(GenBank:EU959275)cDNA全长1 216bp,753bp开放阅读框编码250个氨基酸,推测分子量26.7205kDa,理论等电点为5.12;该蛋白具有高度保守的TIM结构域,与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性;进化树分析表明,玉米TPI与甘蔗亲缘关系最近,处于同一进化支;SDS-PAGE检测结果显示,成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功,为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。 相似文献
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以硬紫草细胞为材料,采用快速扩增cDNA末端法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了由抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)和cDNA芯片技术筛选获得的在黑暗条件下优先表达的LeEXT-1基因的全长cD-NA。生物信息学分析结果表明,该cDNA全长为1 077 bp,编码1个含247个氨基酸的蛋白,与编码伸展蛋白(extensin)的基因具有高度的同源性。基因表达分析结果表明,当紫草细胞从B5培养基转到M9培养基时,LeEXT-1基因在2 h内被快速诱导表达,随后又逐渐降低到一个较低的水平。该基因的克隆为进一步研究伸展蛋白在紫草宁合成调控中的作用奠定了基础。 相似文献
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[目的]获得有活性的重组α-银环蛇毒素(alpha-bungarotoxin,α-BGT)融合蛋白。[方法]将质粒pGEX-α-BGT转入BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS等宿主菌中确定最佳工程菌,并对工程菌进行诱导表达,优化可溶性蛋白的诱导表达条件。[结果]确定JP-α-BGT为表达工程菌,并检测到融合蛋白的表达;可溶性蛋白的最佳诱导表达条件:37℃重培养2.5h后,于22℃以0.50mmol/L的IPTG诱导4h,此时其可溶性融合蛋白的表达量达18.42%。[结论]该研究为后续融合蛋白纯化及α-BGT的分离纯化奠定了坚实基础。 相似文献
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【目的】克隆盐芥谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)基因ThGPX8,对其进行序列分析,构建原核表达载体,为进一步研究ThGPX8的结构和功能奠定基础。【方法】以盐芥为材料,利用RT-PCR技术获得其ThGPX8基因的全长cDNA序列;应用生物信息学手段对该基因编码的蛋白结构和系统进化关系进行分析;构建原核表达载体pET-ThGPX8,转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达、SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。【结果】获得的ThGPX8基因序列的开放阅读框(ORF)为504bp,编码167个氨基酸,具有GPXs的特征结构域,不是跨膜蛋白;其二级结构主要由无规则卷曲组成,三级结构为二聚体。进化树分析表明,盐芥ThGPX8与拟南芥AlyGPX8、AtGPX8和油菜BnGPX8具有较高的同源性。盐芥ThGPX8与ThGPX6的理化性质存在差异,但具有相似的二级结构和三级结构。将ThGPX8转入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达得到了分子质量约23ku的蛋白,该蛋白在37℃下诱导5h可获得较高的表达量。【结论】获得的ThGPX8基因cDNA序列所编码的蛋白属于植物GPXs家族成员,利用构建的原核表达载体pET-ThGPX8转化E.coli BL21(DE3)获得了融合表达蛋白。 相似文献
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【目的】克隆和表达了日本血吸虫CyclophilinA(Sj CyPA)编码基因cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。【方法】从实验室构建的7天童虫消减cDNA文库中,PCR扩增一EST序列的基因全长cDNA,提交到NCBI,登录号为GQ403666。应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达。诱导、表达、纯化和复性重组蛋白,测定其PPIase活性。利用Western blot检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。【结果】PCR获得了Sj CyPA编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为519bp。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在13d童虫表达量最高,为童虫期高表达基因。构建了重组表达质粒pET28a(+)-Sj CyPA,并在大肠杆菌中成功表达。复性重组蛋白具有PPIase活性。Western blot试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得18.72%的减虫率和44.6%的肝脏减卵率。【结论】获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPA基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPA原核重组表达质粒,在大肠杆菌中成功表达,纯化复性得到有PPIase活性的Sj CyPA重组蛋白,并证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。 相似文献
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【目的】旨在克隆板栗CmCAT基因全长cDNA序列,分析其编码蛋白相关信息并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR技术从板栗品种"石丰"中克隆获得CmCAT基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。构建原核表达载体pET28a-CmCAT,经PCR和酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。【结果】板栗CmCAT基因开放阅读框(ORF)为1 479 bp,共编码492个氨基酸,推测蛋白分子质量为56.883 kDa,理论等电点pI为5.83,GenBank登录号为KY312851。其核苷酸序列与核桃(Juglans regia)CAT基因序列相似性最高,为85%。遗传进化分析表明,板栗CmCAT与核桃的亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳分析表明,在30℃条件下,0.2 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最佳,诱导的目的蛋白分子量约为60 kDa,其主要以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了板栗CmCAT基因,并对其编码蛋白的理化性质进行了预测分析,在大肠杆菌中获得了大量的表达,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】克隆细粒棘球绦虫( Echinococcus granulosus , E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体。【方法】 从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株。通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件。并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白。纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性。【结果】 RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x。表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为：当A600为0.6时,以0.3 mmol•L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4 h。SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg•L-1。Western blotting 检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到 1﹕256 000。【结论】在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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利用Real Time-PCR 的方法研究PDK4 基因在肉鸡中的组织表达规律尧在不同生长阶段的组织表达趋势及在不同生长速度肉鸡中的组织差异表达遥结果表明院渊1冤鸡PDK4 基因在肌肉组织渊包括腿肌尧胸肌尧心脏冤表达最高曰渊2冤肌肉组织PDK4 基因在12 胚龄的表达较低袁初生1 日龄时表达最高袁此后有所下降曰渊3冤在垂体尧胸肌尧心脏中袁PDK4 基因在杏花鸡中的表达高于白洛克鸡袁而在腿肌中的表达趋势相反曰胸肌中袁PDK4 基因表达在体重轻组中表达高于重组袁而在腿肌中的表达趋势相反遥 相似文献
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类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor,IGF)信号通路在机体的发育、繁殖以及生长等过程中起着重要的调控作用。类胰岛素生长因子酸不稳定亚基(IGF acid-labile subunit,IGFALS)是IGF系统中的重要一员,可通过延长IGF的半衰期参与IGF信号通路的调控。本研究首次在缢蛏转录组数据库中筛选鉴定了两个IGFALS基因,包含完整的开放阅读框,分别命名为IGFALSa和IGFALSb。IGFALSa基因的cDNA序列为4809 bp,编码996个氨基酸;IGFALSb基因的cDNA序列为1925 bp,编码546个氨基酸。在缢蛏不同发育期的表达分析中发现,IGFALSa和IGFALSb在幼虫的前期发育阶段均只有少量表达,而随着幼虫的发育,其表达量逐渐上升;组织表达分析表明,IGFALSa在外套膜和性腺中高表达,IGFALSb则在水管中高表达。利用不同质量浓度胰岛素短期刺激缢蛏稚贝,当质量浓度为10 mg/L时,两个IGFALS基因表达量均显著上调,其下游基因IRS、PDK1、MPKP1的表达量也显著上调;进一步利用10 mg/L胰岛素长期喂养缢蛏稚贝,结果显示其壳长和壳宽的日生长率均显著提升。 相似文献
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Deregulation of Akt/protein kinase B (PKB) is implicated in the pathogenesis of cancer and diabetes. Akt/PKB activation requires the phosphorylation of Thr308 in the activation loop by the phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1) and Ser473 within the carboxyl-terminal hydrophobic motif by an unknown kinase. We show that in Drosophila and human cells the target of rapamycin (TOR) kinase and its associated protein rictor are necessary for Ser473 phosphorylation and that a reduction in rictor or mammalian TOR (mTOR) expression inhibited an Akt/PKB effector. The rictor-mTOR complex directly phosphorylated Akt/PKB on Ser473 in vitro and facilitated Thr308 phosphorylation by PDK1. Rictor-mTOR may serve as a drug target in tumors that have lost the expression of PTEN, a tumor suppressor that opposes Akt/PKB activation. 相似文献
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【目的】旨在克隆大足黑山羊卵泡抑素（follistatin）的基因序列,并研究其在不同组织中的表达差异。【方法】采用RT-PCR方法从大足黑山羊卵巢组织总RNA中克隆出follistatin的cDNA序列,用相关软件进行序列分析,并利用real-time PCR技术检测follistatin基因在不同组织中的表达。【结果】序列分析表明,大足黑山羊follistatin的cDNA序列全长为1 217 bp,包括该基因完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）1 035 bp,编码344个氨基酸。与牛的核苷酸序列比对同源性高达98%。real-time PCR结果表明,follistatin基因能在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢和垂体中检测出来,在肾脏中表达量相对较高,在垂体中表达量较低。肾脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;心脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;其余各组织间follistatin mRNA含量差异均不显著（P＞0.05）。【结论】成功克隆出大足黑山羊follistatin基因cDNA序列,该基因在肾脏中的表达高于其它组织。 相似文献
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【目的】克隆黄曲条跳甲保幼激素诱导蛋白（Juvenile hormone-inducible protein,Ps-jhip-1）基因,并分析其表达特征。【方法】克隆黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,对其进行系统发育分析,并对其编码蛋白进行生物信息学分析。利用荧光定量PCR方法分析Ps-jhip-1基因在黄曲条跳甲不同组织器官及1个生物钟周期内表达量的变化趋势。【结果】成功克隆了Ps-jhip-1全长cDNA,其长度为1 252 bp,开放阅读框为1 230 bp,编码409个氨基酸。Ps-jhip-1基因编码蛋白具有典型的类蛋白激酶C超家族的蛋白功能域,不具备保幼激素膜受体分子的特征。系统发育分析结果表明,Ps-jhip-1与同为鞘翅目昆虫赤拟谷盗的8种JH诱导蛋白基因聚为一支。荧光定量PCR结果表明,Ps-jhip-1基因mRNA在黄曲条跳甲雌雄成虫的多种组织器官中都有表达,其中在触角和头部的表达量相对较高,而在中足和后足的表达量相对较低,约为触角表达量的6%;Ps-jhip-1基因mRNA表达水平在1个生物钟周期内存在4个下调表达时段,但并未表现出明显的节律性特征。【结论】成功克隆了黄曲条跳甲Ps-jhip-1基因,并分析了其在不同组织及1个生物钟周期内表达量的变化。 相似文献
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甘蔗ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]为甘蔗的基因工程育种提供理论基础和技术储备。[方法]从甘蔗嫩叶中提取总RNA,根据GenBank中甘蔗ACC氧化酶cDNA序列设计2对引物,利用RT-PCR技术扩增甘蔗ACO cDNA序列。构建甘蔗ACO cDNA正义植物表达载体和反义植物表达载体,并利用含ACC氧化酶基因的植物重组表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞。[结果]从甘蔗嫩叶中提取总RNA的OD260/OD280为1.90,说明提取RNA完整性好、纯度高,完全可满足cDNA逆转录的要求。所获得的甘蔗ACC氧化酶cDNA序列全长为969bp,与GenBank中甘蔗ACOcDNA的核苷酸序列同源性为98.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。成功构建了正义植物表达载体pBIaco和反义植物表达载体pBIantiaco,并将其导入根癌农杆菌EHA105中。[结论]该研究为研究该基因的功能和培育甘蔗转基因新种质资源奠定了基础。 相似文献
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长角血蜱卵cDNA表达文库的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo（dT）引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106 PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109 PFU•ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素（DQ248886）的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。 相似文献
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近交五指山小型猪SLA-DQA基因的克隆及在大肠杆菌的原核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
采用RT-PCR方法扩增五指山猪SLA-DQA基因cDNA,克隆入测序载体,测序结果与Gene Bank(登陆号:AY243104)的序列相同,大小为768 bp,该基因编码255个氨基酸残基和一个终止密码,预计蛋白分子量为28 kD.将这个基因克隆到原核表达载体PET-28a(+)中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确,插入到表达载体中,阅读框是正确的,从而构建成重组表达载体PET-28a(+)-DQA.重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,结果表明得到了与预计分子量相同的蛋白. 相似文献
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[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。 相似文献