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1.
本室构建的温度诱导高效表达猪生长激素(pGH)cDNA基因的工程;pPT15/N4830的表达效率为30％左右。相差显微镜下可见表达细菌内有包涵体(inclusion bodies, IBs)存在。高速离心(12000g,10min)pGH主要在沉淀内。由于细菌在某些条件下也能产生其他IB颗料,为了证实我们见到的IBs是由pGH的产生而形成的,以及pGH在大肠杆菌内的分布情况,我们用免疫胶体金技术对诱导后的大肠杆菌进行了观察。所用的一抗为本室制备的兔抗猪生长激素多克隆抗体(滴度为32000),使用时稀释100倍;所用的二抗是10nm金颗料标记的SPA(军事医学科学院陈德惠教授惠赠),使用时稀释20倍。其他操作按常规进行。结果表明:1.大肠杆菌内产生的pGH以IBs的形式存在,IBs的大小不一,平均每个细菌内有3～4个IBs。2.IBs以外没有观察到pGH的存在,这与破细胞离心后上清的免疫印渍(Western blotting)结果相吻合。3.与文献报道的免疫酶标技术相比,用免疫胶体金技术观察的结果更加清晰。方法简便,容易掌握。 相似文献
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采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从耐玉米穗粒腐病自交系R15中分离得到病程相关蛋白1(pathogenesis-related protein 1,PR1)基因的开放阅读框,命名为ZmPR1,测序结果显示该序列长为528bp,编码175个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.7ku.利用NCBI/Blastp和Genedoc软件进行同源性比对显示,ZmPR1基因编码蛋白与水稻、小麦、拟南芥等高等植物中的PR1蛋白相似性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白(cysteine-rich secretory protein,CAP)的保守结构域.将构建的重组载体pET32a(+)-ZmPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同的诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度下对诱导条件进行优化.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,ZmPR1基因的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.6mmol爛L-1,诱导温度28℃,且诱导时间对表达量影响不大.免疫印迹(Western blot)检测证实有39ku的融合蛋白表达,表明ZmPR1基因在大肠杆菌中已成功表达,这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备提供了一定的基础. 相似文献
3.
为了确定重组鸭α-干扰素(DuIFN-α)基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α的最佳表达条件,对影响原核表达的主要因素:IPTG浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡萄糖浓度及培养基进行了优化;并利用抗性筛选对表达质粒的稳定性进行了研究。结果显示,诱导基因工程菌BL21(DE3)/pET32a+-DuIFN-α表达DuIFN-α的最佳条件为:以TB+5 g/L葡萄糖培养基37℃培养至菌体OD600=0.8~1.1时,加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L,30℃诱导培养4~5 h。在最佳表达条件下,DuIFN-α的相对含量为34.1%,总含量(终菌体浓度×相对含量)达79.9;各种优化条件对表达质粒的稳定性未见明显影响。 相似文献
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SEPALLATA3(SEP3)属于花器官建成ABCE模型中的E类基因,为了揭示SEP3蛋白是如何形成多聚体的,以及多聚体与其生物学功能之间的联系,开展了拟南芥Arabidopsis thaliana AtSEP3蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli细胞中进行重组蛋白的诱导表达。从蛋白不同的结构域、诱导时间和诱导温度等方面对蛋白的可溶性表达进行了分析。最后以pET-15b为表达载体,大肠埃希菌表达菌株E.coli‘Rosetta’为宿主菌株,22℃诱导表达15 h,获得不同片段的AtSEP3可溶性蛋白。通过镍柱及分子层析色谱柱分离纯化,表明AtSEP3蛋白以四聚体形式存在。图4参13 相似文献
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对影响基因工程猪生长激素(r—pGH)体外复性效率的因素进行了研究，结果表明：复性液组成、变性剂种类、复性方法的选择、变复性pH对r—pGH体外复性效率有较大影响，β-巯基乙醇、谷光苷肽等添加剂对r-pGH的体外复性影响不显著。提取包含体用6mol／L盐酸胍溶解，空气氧化80h后转入复性缓冲液中开始重组蛋白复性，采用透析复性法——复性缓冲液Ⅲ(0．25％NaHCO3，0．2％α-乳糖，0．2％甘露醇)，pH90，透析5～6次，可较好地恢复r—pGH生物活性。复性后蛋白浓缩液进行去垂体大鼠试验，大鼠增重明显，表明得到了正确折叠的较高生物活性的r—pGH。 相似文献
8.
Pichia pastoris表达β-葡萄糖苷酶基因研究 总被引：4，自引：0，他引：4
采用Pichiapastoris(毕赤酵母)表达系统表达拟南芥β-葡萄糖苷酶基因(AT5g44640),获得了有活性的目的蛋白.研究了影响β-葡萄糖苷酶基因表达的因素.结果表明,表达载体整合拷贝数、不同P.pastoris菌株、甲醇体积分数、诱导培养时间和诱导培养起始的D(600nm)等对β-葡萄糖苷酶的产量都有一定的影响. 相似文献
9.
从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法克隆大鳞副泥鳅生长激素基因(pGH)cDNA。结果表明,克隆到的pGH的开放阅读框包括633 bp,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽,GenBank注册号为DQ350432。把pGH成熟肽的cDNA插入真核表达载体pPIC3.5K,PCR技术、酶切和测序证明重组子中确实定向插入了pGH成熟肽片段;将重组的pPIC3.5K-pGH用SalⅠ酶切后,转化巴斯德毕赤酵母GS115,PCR技术筛选证明pGH已经整合到酵母染色体上。从而成功克隆大鳞副泥鳅生长激素基因cDNA,并构建了胞内真核表达载体pPIC3.5K-pGH。 相似文献
10.
[目的]优化基因工程菌的诱导表达条件,以提高抗呋喃它酮代谢物衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量.[方法]采用液体发酵法培养抗AMOZ衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的基因工程菌,分别研究不同宿主菌、培养基、初始pH、诱导时期、诱导时间和蛋白诱导表达剂异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)对融合蛋白表达量的影响,并通过蛋白质印迹法和直接竞争酶联免疫分析法对其活性进行鉴定.[结果]以E.coli BL21(DE3)作为宿主菌,在以初始pH为7.0的SB液体培养基作为发酵培养基,将含有目的蛋白的基因工程菌培养至OD600为0.6时,用浓度为0.6 mmol/L的诱导表达剂IPTG诱导表达9 h的条件下,抗AMOZ衍生物单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达量由最初的7.94％增加到了11.45％,总体增加了约3.51％,且融合蛋白具有良好的生物活性.[结论]成功提高了抗AMOZ衍生物单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达量,为后期大规模生产抗AMOZ衍生物单链抗体奠定了一定的基础. 相似文献
11.
藏猪生长激素基因(pGH)多态性研究 总被引：4，自引：0，他引：4
猪生长激素基因(pGH)是猪生长发育性状重要的候选基因之一。采用PCR-RFLP技术检测藏猪pGH基因+159~+734 bp片段的DraI、ApaI和MspI酶切多态性。结果显示,藏猪群体中DraI酶切全部切开,无多态;ApaI酶切具有4个等位基因,出现5种基因型,其中CC基因型(299A/432C)频率最高,为0.7857;藏猪群体MspI酶切出现3种基因型,杂合性CT基因型频率最高,为0.5089,等位基因C和T频率分别为0.5580和0.4420。经比较,藏猪pGH基因DraI酶切位点与其他猪种一样无多态性,而ApaI酶切出现了特异的432突变位点,MspI酶切等位基因分布相对均衡,表现出与其他猪种的差异。 相似文献
12.
不同品种猪生长激素基因的PCR-RFLPs分析 总被引：3，自引：2，他引：3
采用PCR-RFLPs技术,对香猪、上海白猪、大约克夏猪生长激素基因-119～＋715区域共834bp片段的扩增产物分别用ApaI、DraI、MspI三种限制性内切酶检测酶切位点的多态性。结果显示：ApaI酶切时．三个品种的猪都产生了3种基因型（AA、BB和AB）,BB基因型的频率以大约克夏猪最高．AB基因型的频率以香猪最高．三个猪种间基因型频率、等位基因频率的差异不显著（P〉0．05）;DraI酶切时．各品种猪均未呈现酶切位点的多态性;MspI酶切时,仅大约克夏猪表现出2种基因型（CC、CD）,香猪、上海白猪未产生酶切位点多态性。结论：AB基因型的频率以香猪为最高,它可能是小型猪的有利基因型;在香猪和上海白猪中DraI和Mspl酶切位点的多态性比较贫乏。 相似文献
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猪生长激素基因第二外显子区遗传变异的序列基础 总被引：11，自引：0，他引：11
采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及ＰＣＲ产物有直接序列分析方法，对猪一长激素基因第二外显子外遗传变异的序列基础进行了研究，ＰＣＲ扩增片段长度为２３０ｂｐ，包含全部的生长激素基因的第二外显子序列（１６１ｂｐ）共分析了６头二花脸和６头长白猪，结果表明：在猪的生长激素基因第二外显子子区，共有７处碱基替换，依次为５０７处的Ｃ／Ｔ替换，５２０处的Ｃ／Ｔ替换，５４６处的Ｇ／Ａ替换，５５５处的Ｇ／Ａ替换，５５６处的Ｃ 相似文献
14.
[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础. 相似文献
15.
【目的】 研究拟克隆薰衣草DXS基因,并分析其表达,为揭示该基因在调控薰衣草萜类物质合成中的分子机理提供研究基础。【方法】 以薰衣草杂花为试材,同源克隆薰衣草DXS基因,进行基因序列分析、表达量比较和原核表达。【结果】 (1)薰衣草DXS基因开放阅读框长为2 181 bp,编码由726个氨基酸组成的蛋白质序列;薰衣草DXS蛋白等电点为6.57,分子量约为78.39 KDa,具有高度的保守性,与狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花的DXS蛋白亲缘关系相近;(2)DXS基因在杂花花器官的衰败期表达量最高,在法国蓝花器官的盛开期表达量最高,DXS基因在杂花花器官五个不同发育时期的表达量均高于法国蓝;DXS基因在杂花花萼中表达量最高,在法国蓝雄蕊中表达量最高,DXS基因在杂花花器官5个不同组织表达量均高于法国蓝(雌蕊、雄蕊除外);(3)在37℃、IPTG 0.8 mM条件下诱导4 h后,DXS蛋白表达量最大。【结论】 DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系。 相似文献
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鲎抗菌肽polyphemusinⅡ基因的改造、克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引：3，自引：0，他引：3
中国鲎(Tachypleus trideutatus)血细胞产生的抗菌肽(Antibacterial peptide)—鲎素,具有广谱的杀菌、抑病毒和抗肿瘤细胞的作用。实验根据已报道的美洲鲎的抗菌肽polyphemusinⅡ氨基酸序列,设计了一对引物,并对原抗菌肽基因进行改造,在基因开放阅读框末端添加了Asn密码子,使抗菌肽羧基末端酰胺化,旨在提高其稳定性和抗菌活性。PCR扩增获得改造过的目的片段,连接于载体pMD18-T,测序后,与pEI-28c(+)连接,构建表达质粒pET28c-rr,测序鉴定正确后,转化大肠杆菌E.coli.BK21(DE3)。表达菌株经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导后以包涵体的形式表达,在体外表现出明显的抑菌活性。 相似文献
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ZONG Xiaolin HA Zhuo ZHAO Lili LIU Diqiu QIAO Xinyuan JIANG Yanping GE Junwei LI Yijing TANG Lijie 《东北农业大学学报(英文版)》2011,18(4):32-38
Lactobacillus was selected as a bacterial carrier for expression of N-lobe of porcine lactoferrin （PLFN）. A pair of primers was designed with Oligo6.0 and used to amplify PLFN gene. It was in accordance with the characters of translational fusions from gene and expression vector plasmid. A 1 077 bp fragment of the gene from PLF was cloned from mammary gland tissue of the lactating sow on the third day by RT-PCR; the gene was connected with the vector plasmid pPG612.1 and transformed into the host strain JM109. The recombinant expression vector plasmid pPG612-PLFN was created and identified by using plasmid extraction, PCR, restriction enzyme digestion and sequence analysis. The recombinant plasmid was transformed into Lactobacillus casei ATCC393, Lactobacillus plantarum KLDS 1.0344, Lactobacillus paracasei KLDS 1.0652 and Lactobacillus pentosus KLDS 1.0413 by electroporation, and produced the recombinant strains of pPG612-PLFN/L, casei, pPG612-PLFN/L, plantarum, pPG612-PLFN/ L. paracasei and pPG612-PLFN/L, pentosus, respectively. The results indicated that PLFN gene had inserted into the expression vectors and achieved multiple Laetobacillus expression systems. It electes the base for the expression and production of recombinant porcine lactoferrin in Lactobaeillus 相似文献
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采用RT-PCR方法扩增出狂犬病病毒(RV)CVS株核蛋白(N)基因,并将目的基因亚克隆入原表达载体pET-28 a(+)中,经PCR、双酶切以及序列分析,结果表明:已成功构建了重组质粒.将重组质粒转化至大肠埃希氏菌Rossetta(DE3),在37℃,1 mmol/L IPTG条件下进行诱导表达.诱导产物经SDS-PAGE分析,在分子量约为54 KD附近出现较粗的目的带,与预期的目的蛋白分子量相符合.经表达条件优化,用1 mmol/LIPTG在37℃诱导表达5 h,表达量达到最高,Western-Blotting鉴定目的蛋白有较强的免疫原性.为狂犬病毒的N蛋白的新型疫苗的制备奠定了基础. 相似文献