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1.
《南京农业大学学报》2020,(5)
[目的]本研究通过对大豆E3泛素连接酶基因GmPUB1的克隆及在拟南芥中异源表达,探究E3泛素连接酶在大豆生长发育和非生物胁迫中的作用。[方法]克隆大豆E3泛素连接酶基因GmPUB1,并对其进行生物信息学分析。利用qRT-PCR技术分析该基因在不同组织中以及不同胁迫处理下的表达模式。通过洋葱表皮细胞瞬时表达系统对GmPUB1蛋白进行亚细胞定位分析。在拟南芥中异源表达GmPUB1并对其表型进行分析。[结果]GmPUB1基因(Glyma.14g212200)的CDS序列为1 320 bp,编码439个氨基酸且该蛋白相对分子质量和等电点分别为48.63×10~3和8.35。qRT-PCR分析发现GmPUB1在开花后30 d的种子中表达最高。在PEG3350、NaCl、4℃及JA等非生物胁迫诱导下,GmPUB1均上调表达。GmPUB1蛋白在整个细胞内分布。过表达GmPUB1的转基因拟南芥株系的千粒质量显著提高,氨基酸含量发生改变,尤其甲硫氨酸含量显著升高,种子萌发率降低。转基因拟南芥株系具有耐盐性,但对干旱以及ABA敏感。[结论]GmPUB1基因可参与调控种子生长发育并响应逆境胁迫。 相似文献
2.
[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料. 相似文献
3.
[目的]研究丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP)在凡纳滨对虾天然免疫应答过程中的作用。[方法]利用PCR技术克隆凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶基因(Lv-SP),并进行生物信息学分析,进一步通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对其进行组织表达分析以及白斑杆状病毒(WSSV)刺激后的表达变化分析。[结果]成功从凡纳滨对虾体内克隆了Lv-SP基因的开放阅读框ORF,碱基数为1 104 bp,共编码367个氨基酸,在线分析软件预测其蛋白分子量为41 k D,等电点PI为6.93;在线分析软件预测显示:Lv-SP基因预测的氨基酸序列保守性很高,含有1个clip结构域和1个高度保守的SP结构域(Tryp-SPc);系统进化发生分析表明:Lv-SP氨基酸序列与中国明对虾以及中华绒螯蟹的丝氨酸蛋白酶(SP)同源性较高,而与按蚊、小蜂窝甲虫的SP同源性较低;qRT-PCR分析结果显示:Lv-SP基因在凡纳滨对虾不同组织中均有表达,并且在鳃和血中表达量较高,而在心和肝中表达量较低,病毒WSSV刺激后,Lv-SP基因在48.0 h和72.0 h有显著的上调表达趋势。[结论]Lv-SP基因保守性比较高,并且其在一定程度上参与了对虾应答病毒侵染的免疫反应,推测它有可能作为重要的免疫调控基因在对虾的防御应答过程中发挥作用。 相似文献
4.
为明确中间球海胆Strongylocentrotus intermedius smad2/3基因(命名为Si-smad2/3)信息,初步研究了该基因的序列特征、组织表达模式及脂多糖对其表达的影响,采用RACE技术克隆获得了成体中间球海胆Si-smad2/3基因的全长cDNA序列。结果表明:Si-smad2/3基因的cDNA全长为2146 bp,共编码446个氨基酸;生物信息学分析发现,Si-smad2/3基因所编码的蛋白相对分子质量为50 300,等电点为6.93,属于亲水性非跨膜蛋白;通过与9种已公布物种的smad2/3蛋白氨基酸序列进行多重序列比对和系统进化分析发现,中间球海胆Si-smad2/3蛋白的氨基酸序列与其他真核生物smad2/3蛋白序列具有较高的相似性,与紫球海胆Strongylocentrotus purpuratus smad2/3蛋白的一致性高达96%,符合中间球海胆的分类和进化地位;实时定量PCR(qRT-PCR)检测结果显示,Si-smad2/3基因在中间球海胆不同组织中均有表达,其相对表达量从高到低为体腔细胞管足性腺围口膜肠齿间肌;利用脂多糖(LPS,0.1 mg/mL)对中间球海胆进行免疫刺激发现,与对照组相比,LPS刺激后Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞、管足和围口膜中均呈先升高后降低的表达趋势,其中,Si-smad2/3基因在中间球海胆体腔细胞中的相对表达量在LPS刺激9 h时达到峰值,管足中表达量在LPS刺激6 h时达到峰值,而围口膜中的表达量在LPS刺激72 h时达到峰值。研究表明,Si-smad2/3可能参与中间球海胆的免疫应答过程且免疫响应具有组织特异性。 相似文献
5.
[目的]建立基于大鲵凝集素多克隆抗体酶联免疫定量分析的方法。[方法]以大鲵凝集素为抗原,免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,建立间接非竞争酶联免疫检测方法,并对该方法的精密度及准确度进行了测试。[结果]获得的抗血清效价为1∶16 000,多克隆抗体血清的最佳稀释度为1∶3 000,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗最佳稀释度为1∶30 000,抗原浓度在31.25~1 000.00 ng/m L范围内呈良好的线性关系,相关系数R~20.99,板内及板间变异系数范围分别为2.50%~9.88%和2.69%~11.59%,回收率为91.5%~109.5%。分布结果显示,大鲵凝集素在躯干部肌肉组织中的含量较高。[结论]成功建立了大鲵凝集素间接非竞争酶联免疫检测方法,该方法灵敏度高,重复性好,可用于实际检测大鲵肌肉组织中的凝集素含量。 相似文献
6.
《东北农业大学学报》2016,(11)
对龙葵Sor UBC基因克隆并分析其在多种非生物胁迫处理下表达特性,为E2泛素结合酶在植物逆境胁迫中应用提供理论依据。试验采用电子克隆结合RT-PCR方法从龙葵中克隆得到泛素E2结合酶UBC基因编码区序列,命名为Sor UBC,登陆Gen Bank,编号:KU233684。Sor UBC基因编码区全长888 bp,编码295个氨基酸。进化树分析显示,该基因编码氨基酸序列与马铃薯、番茄同源性最高,为95%,其次是烟草,为91%。该蛋白在第266~284氨基酸位具有1个跨膜螺旋区域,泛素化位点预测表明其含有8个泛素化位点。利用荧光定量PCR技术分析Sor UBC基因在龙葵各器官表达特征和不同非生物胁迫处理下(干旱、盐、碱、高温和低温)根部和叶片表达特性,同时测定龙葵叶片生理响应。结果表明,SorU BC基因表达具有组织差异性,在叶片和果实中表达量较高。非生物胁迫处理(干旱、盐、碱、高温和低温)后根部和叶片基因表达情况显示该基因存在早期(3或5 h)应答上调表达,且根部与叶片基因表达量和变化趋势差异显著,根部表达量变化比叶片显著,推测Sor UBC基因在龙葵早期响应干旱、盐、碱、高温和低温非生物胁迫中起调控作用。生理特征数据表明,在干旱、盐和高温胁迫中龙葵叶片MDA含量变化差异不显著,POD和SOD活性总体呈先降后升趋势,说明其在胁迫后期(9 h)对活性氧造成的损伤起缓解作用。 相似文献
7.
[目的]研究法氏囊病毒VP2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点。[方法]以接种传染性法氏囊病毒(IBDV)的鸡胚尿囊液为模板,根据Genbank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的全序列设计引物,通过RT-PCR扩增获得VP2高变区部分片段,将其克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)BL21,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个504bp的扩增片段,序列分析结果表明它与GenBank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的核苷酸序列同源性达99.8%,其氨基酸序列的同源性为99.4%,说明各毒株间高变区基因序列保守性很高。[结论]法氏囊炎病毒毒株在两个大小亲水区内的氨基酸都非常保守。 相似文献
8.
[目的]发掘并研究小麦TaTVP1基因响应耐盐、耐旱等非生物胁迫的功能与机制，为小麦抗逆育种提供新的基因资源。[方法]利用PCR技术克隆小麦TVP1基因，扩增获得cDNA全长序列，并对其进行生物信息学分析，进一步利用qRT-PCR技术分析其表达模式。[结果]小麦TVP1基因全长2 289 bp,编码762个氨基酸；其氨基酸序列具有12个跨膜结构，该结构中疏水氨基酸具有高度保守性，且肽链N末端与C末端均位于膜外，预测该跨膜结构可形成具有明显孔道的高级3D结构蛋白，推测与其具有的H+离子泵通道功能密切相关；系统发育树分析表明，TaTVP1蛋白与单子叶植物TVP1蛋白的同源性较高，该类蛋白在进化过程中单子叶和双子叶植物可形成2个明显的类群Ⅰ和Ⅱ;定量PCR分析表明，小麦中TVP1基因在根、茎中的表达量要明显高于叶、穗中，具有组织特异性，且不同材料间同一组织中该基因的表达趋势也存在差异，这可能与不同材料间的耐旱等抗逆性存在差异有关。[结论]克隆并分析了小麦TaTVP1基因，为进一步阐明该基因参与抵御非生物胁迫的机理奠定一定的研究基础。 相似文献
9.
[目的]对从水稻幼苗中分离的2个3型金属硫蛋白基因OsMT-I-3a和OsMT-I-36的结构进行了分析,并对其表达模式进行了检测。[方法]利用Blast搜索水稻数据库,设计引物并利用RT—PCR的方法克隆OsMT-I-3基因cDNA全长。通过多重比对等方法对其基因和蛋白结构进行了分析。利用Northem杂交对这两个基因的组织表达模式和环境应答模式进行了检测。[结果]OsMT-I-3a和OsMT-I-3b分别编码62和65个氨基酸的多肽,具有典型的3型金属硫蛋白的半胱氨酸分布模式。OsMT-I-3a基因在叶片中没有检测到表达,OsMT-I-3b在叶片中高表达,且各种非生物胁迫因素会影响两种基因的表达模式。[结论]I类3型2个水稻MT基因可能参与水稻多种环境胁迫的信号通路,在水稻抗非生物胁迫过程中起作用。 相似文献
10.
[目的]采用电子克隆技术克隆红鳍东方鲀组织蛋白酶L基因,并应用生物信息学技术分析其推导氨基酸的序列特征,为进一步探索其在免疫功能中的作用奠定基础.[方法]以斑马鱼的组织蛋白酶L核苷酸序列(Y08321.1)为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLASTn分析,将检索到的匹配结果进行碱基3′端及5′端的适当延长,用DNAssist预测其编码信息;然后从GenBank获取若干物种组织蛋白酶L序列,用DNASTAR软件进行比对.[结果]红鳍东方鲀组织蛋白酶L基因全长2005 bp,含7个外显子和6个内含子;包含编码336个氨基酸的开放阅读框(1011 bp);其推导的氨基酸序列具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守结构域(ERWNIN和GNFD)及由Cys25、His159和Ash175残基组成的保守活性位点,与青鳉、鲤鱼的组织蛋白酶L基因具有较高的序列一致性.[结论]红鳍东方鲀组织蛋白酶L的一些结构域和催化活性位点在进化过程中比较保守,与鱼类物种来源的组织蛋白酶L在氨基酸水平上一致性较高,在进化上亲缘关系较近. 相似文献
11.
[目的]明确卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因(TroCatL)的遗传进化规律及其组织表达水平,为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据.[方法]应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;并以实时荧光定量PCR(qPCR)检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性.[结果]TroCatL基因全长cDNA为1492 bp(GenBank登录号MH036350),包括开放阅读框(ORF)1011 bp、5'端非翻译区(5'-UTR)120 bp和3'端非翻译区(3'-UTR)361 bp. TroCatL基因编码336个氨基酸残基,其理论等电点(pI)5.7,预测分子质量37.93 kD,且存在CatL特有的保守结构域(ERFNIN、GNFD和GCXGG基序)及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点.TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%~95.2%,尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近. TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达,以在肝脏中的表达最高,在脑组织中的表达最低.经溶藻弧菌感染后,TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调,肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值,血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值.[结论]TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守,通过参与机体的免疫应答反应,在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色. 相似文献
13.
[目的]获得松江鲈β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并检测松江鲈β-肌动蛋白在组织中的表达。[方法]以松江鲈肌肉总RNA为模板,采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE的方法扩增β-肌动蛋白基因cDNA片段,用RT-PCR方法检测组织表达。[结果]获得了松江鲈β-肌动蛋白基因cDNA的3个片段,测序后拼接得到1 905 bp全长cDNA序列,其包含了1 128个核苷酸的开放性阅读框,翻译编码375个氨基酸。核苷酸和氨基酸同源性分析发现,松江鲈β-肌动蛋白基因序列与点带石斑鱼、军曹鱼、红鲷鱼等同源性相对较高,与哺乳动物和鸟类同源性相对较低;系统发育分析表明,松江鲈β-肌动蛋白与点带石斑鱼关系最近。RT-PCR分析表明,该基因在检测的肌肉、肝脏、肠和脑4种组织均有表达。[结论]首次得到了β-肌动蛋白基因cDNA全长序列,并证明了松江鲈的β-肌动蛋白基因非常保守。 相似文献
14.
[目的]更好了解香蕉果实与水分代谢的关系。[方法]依据从抑制差减杂交文库(SSH)中获得的一个cDNA序列,设计5′和3′RACE引物,从香蕉果实中扩增基因5′和3′末端片段,并用RT-PCR的方法探讨该基因在香蕉各组织中的表达情况。[结果]获得一个1 132 bp的水通道蛋白全长基因,命名为MaPIPl;1。MaPIPl;1基因包含861 bp的完整阅读框架,编码的蛋白有6个跨膜结构及aspara-gine-proline-alanine(NPA)和aromatic/arginine 2个保守区。其与水稻水通道蛋白基因OsPIP1;2在氨基酸序列上有94.1%的一致性和97.9%的相似性。且MaPIP1;1在香蕉各器官中均稳定表达。[结论]MaPIPl;1可能与香蕉的水分代谢相关。 相似文献
15.
[目的]了解鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因分子生物学特性,确定其编码蛋白抗原性,为鸭疫里默氏杆菌亚单位疫苗研发提供新的靶标抗原选择.[方法]采用PCR克隆鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因,以DNASTAR和NCBI数据库分别进行基因生物信息学分析;利用pCold-TF原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达,并分别以SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达形式及其抗原特异性.[结果]从鸭疫里默氏杆菌基因组扩增获得的AS87-01740基因编码框全长618 bp,编码205个氨基酸,理论分子量约21.87 kD,理论等电点(pI)8.2,正电荷氨基酸总数17个,负电荷氨基酸总数16个.AS87-01740蛋白序列在同种属分离株中,与2型血清型分离株(11845、YM、GD和CH-2)有很高的相似性(>99%),与1型血清型分离株(CH-1和CH-3)的相似性为92%;在不同种属中,与金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)、动物溃疡伯格菌(Bergeyella zoohelcum)和脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabeth-kingia meningosepticum)的相似性分别为61%、60%和57%.经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得的融合蛋白分子量约77 kD,以可溶性表达形式为主.Western blotting检测结果表明,融合蛋白能与鸭疫里默氏杆菌阳性血清发生特异性免疫反应.[结论]AS87-01740基因编码蛋白在不同鸭疫里默氏杆菌分离株中具有很高的保守性,且能与其阳性血清发生特异性免疫反应,是研发鸭疫里默氏杆菌疫苗的潜在抗原. 相似文献
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[目的]对高邮麻鸭白细胞介素-2（CIL-2）基因进行克隆和序列分析。[方法]以高邮麻鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,根据已发表的鸭IL-2基因cDNA序列设计并合成1对引物,应用两步RT-PCR技术扩增出IL-2基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-T-easy载体,并进行测序分析和结果验证。[结果]阳性克隆所含插入片段的DNA序列全长为433bp,与预期大小一致,含有1个423bp大小的开放性阅读框,共编码141个氨基酸的前体蛋白,N端21个氨基酸形成信号肽,成熟蛋白为120个氨基酸,分子量约为13.66kD,含1个糖基化位点。该序列与绿头鸭、绍兴鸭、固始鸭相应序列的同源性均为99.8%,与广州白鸭的同源性为99.3%,存在少量核苷酸差异。[结论]高邮麻鸭IL-2编码区基因相对高度保守,为其用于临床疾病治疗提供了一定参考。 相似文献
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【目的】克隆斑节对虾(Penaeusmonodon)泛素结合酶E2 H基因(UBE2H),了解其组织特异性表达情况,为揭示UBE2H在斑节对虾卵巢发育过程的作用提供依据。【方法】PCR扩增斑节对虾UBE2H基因的开放阅读框,利用实时荧光定量PCR检测UBE2H基因在斑节对虾各组织及不同发育期斑节对虾肝胰腺和卵巢中的表达情况;并构建pET32a-UBE2H原核表达重组质粒,进行诱导表达及蛋白纯化。【结果】克隆获得的斑节对虾UBE2H基因全长1010 bp (GenBank登录号KU870456),其中,5'非编码区77 bp,3'非编码区378 bp,开放阅读框555 bp(编码184个氨基酸)。斑节对虾UBE2H蛋白等电点(pI)4.88,分子量20.85 kD。斑节对虾UBE2H氨基酸序列与其他物种相似度很高,为78.00%~83.00%。实时荧光定量PCR检测结果显示,UBE2H基因在斑节对虾淋巴组织中表达量最高,其次为鳃;在斑节对虾不同卵巢发育期肝胰腺和卵巢中的表达量均呈先上升后下降的变化趋势,但其峰值出现时间存在差异,肝胰腺的最高表达量出现在卵巢III期,卵巢的最高表达量出现在卵巢II期。经原核表达获得的斑节对虾UBE2H融合蛋白约39.00 kD,纯化后的蛋白浓度为2.92μg/μL。【结论】斑节对虾UBE2H参与了其卵母细胞发育和肝胰腺中卵黄蛋白的转运过程,与斑节对虾的卵巢发育密切相关。 相似文献
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[目的]分析家蚕丝氨酸蛋白酶(SP)基因序列BmSP25及转录情况,明确其表达规律对防御家蚕核型多角体病毒(BmNPV)入侵的免疫应答机制,为揭示BmSPs在家蚕免疫应答方面的功能作用提供理论依据.[方法]克隆BmSP25基因序列,对该基因编码蛋白的氨基酸序列、分子量、结构域等进行生物信息学分析;利用GeneDoc和MEGA 5.0对BmSP25氨基酸序列进行多序列比对及系统发育进化树分析,采用半定量RT-PCR对家蚕不同组织和发育时期的BmSP25基因转录情况进行分析,并以实时荧光定量PCR检测BmSP25基因在BmNPV感染家蚕中肠组织中的转录水平.[结果]BmSP25基因的ORF全长885 bp,编码294个氨基酸,其中第1~17位氨基酸为信号肽,去信号肽的分子量为29.1 kD,理论等电点为7.8.BmSP25蛋白由4个α螺旋、15个β折叠和一些无规则卷曲构成;其氨基酸序列同源性比对分析发现,BmSP25(BGIBMGA008514-PA)与蓓带夜蛾SP序列(GenBank登录号ADM35105)的同源性最高,为62.1%.BmSP25基因在家蚕中肠组织中特异表达,且在整个幼虫时期呈持续性表达.BmSP25基因在家蚕感染BmNPV后发生明显变化,至感染6 h时呈下调趋势,而在感染3、12和24 h时均呈明显上调表达.[结论]BmSP25在防御BmNPV入侵家蚕的免疫应答过程中发挥重要作用.鉴于昆虫SP具有高度保守的底物特异性位点,因此可利用底物类似物、基因定点突变等方式来预防农林害虫. 相似文献
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不同生态型拟南芥FLC基因的序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]对拟南芥春化作用相关基因FLC的序列分析。[方法]先期经过对拟南芥自然群体的春化反应的QTL分析,发现拟南芥5号染色体上有一个与开花有关的QTL,本实验就是运用序列分析确定它与FLC基因是否具有同源性。[结果]意大利拟南芥与瑞典拟南芥在第27位、第461位、第501位、第638位、第738位、第884位碱基上不同。虽然这些碱基有所不同,但是密码子编码出来的第9个氨基酸、第167个氨基酸、第246个氨基酸,由于密码子的简并性,编码的蛋白质均相同。[结论]拟南芥具有丰富的遗传多样性,其FLC基因序列长度高度保守、碱基变异位点丰富密码子的简并性它们均编码同一种氨基酸对拟南芥生长没有影响。这表明拟南芥的基因序列会受到环境的影响。 相似文献