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1.
【目的】揭示棉田杂草薤白（Allium macrostemon Bunge）抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶（EPSPs）基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1 821 bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A重组后,构建成重组表达质粒pRSET-A-EPSPsA,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导了目标蛋白的高效表达。经SDS-PAGE电泳分析显示,该蛋白的分子量约为55 kD,与预期大小一致。通过草甘膦对表达细菌处理,表达菌对草甘膦的抗性显著提高。【结论】薤白EPSPs对草甘膦具有一定抗性。 相似文献
2.
受PVY诱导的烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp的克隆与分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】通过筛选并克隆烟草抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)相关基因,分析其在不同诱导时间的相对表达量,揭示烟草抗病毒诱导的分子机理,以期为烟草抗病毒病育种奠定基础。【方法】通过抑制差减杂交和cDNA芯片从PVY诱导的抑制差减杂交文库中筛选上调表达(Ratio2)的基因中间片段,用RACE技术克隆其cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR分析其在不同诱导时期的相对表达量。【结果】从受PVY诱导的烟草叶片中筛选一条595bp的基因中间片段并克隆得到一个全长为1770bp的天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp(GenBank登录号为GU144571),该基因编码506个氨基酸。多序列比对结果显示,该基因的编码产物与其它植物天冬氨酸蛋白酶家族成员具有高度的同源性,具有植物天冬氨酸蛋白酶典型的结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,Ntasp在PVY接种早期上调表达。【结论】克隆得到一个烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp,其表达受PVY侵染诱导。 相似文献
3.
【目的】克隆烟草NAC类转录因子基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究NAC类转录因子对烟草打顶后根系的生长发育与烟碱生物合成之间的关系奠定基础。【方法】采用电子克隆结合RT-PCR获得烟草NtNAC-R1全长cDNA序列,并进行生物信息学分析,用pRESTB原核表达系统进行该基因的原核表达。分别采用RT-PCR和Northern杂交对烟草打顶前、后根尖组织中NtNAC-R1的表达模式进行分析。【结果】烟草NtNAC-R1开放性阅读框架长度为936 bp,编码311个氨基酸,具有NAC转录因子家族典型的保守结构域。系统进化分析表明,该基因与矮牵牛NAC亲缘关系较近,属茄科植物特异NAC家族,在原核细胞中具有表达活性。该基因在烟草根中的表达水平最高,在烟草打顶后2—4 h表达水平下降,随后上升。【结论】从烟草根尖组织中克隆了一个NAC转录因子基因NtNAC-R1,该基因在根系中具有高水平表达,在烟草打顶后2—4 h表达水平显著降低,具有响应烟草打顶所导致的信号传递作用。 相似文献
4.
甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。 相似文献
5.
【目的】克隆胞内分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对其基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET32a-HBHA,并进行诱导表达。【结果】胞内分枝杆菌HBHA基因完整的ORF全长618bp,编码205个氨基酸,该基因氨基酸序列与M.avium ATCC 25291有较高的相似性。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建了pET32a-HBHA原核表达载体,其可在原核表达系统中诱导表达大小约为38ku的HBHA重组蛋白。【结论】胞内分枝杆菌HBHA是一种抗原指数较高的碱性、亲水性蛋白,可在原核表达系统中被表达。 相似文献
6.
烟草抗马铃薯Y病毒病相关基因NtPsaN的克隆及表达分析 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PCR结果显示接毒之后该基因表达与不接毒对照相比有明显上调趋势。【结论】克隆得到一个烟草PVY抗病相关基因NtPsaN,其表达受PVY侵染诱导,该基因可能在烟草抵御PVY病害侵染过程中起重要作用。 相似文献
7.
【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-I)原核表达载体,表达可溶性Fdn-I蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-I在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-I全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-I,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-I与GST融合表达载体pEGX-Fdn-I,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-I可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-I蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-I的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol?L-1条件下表达出大小为41.3 kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6 400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-I的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-I在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-I大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-I的表达。 相似文献
8.
【目的】从野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）中克隆非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7 cDNA,并解析其功能。【方法】采用同源基因设计引物,并根据RT-PCR方法克隆StLTPa7 cDNA序列;通过农杆菌浸染法转化烟草,构建StLTPa7过表达转基因烟草植株;采用菌丝生长速率法检测转基因烟草植株蛋白提取物对大丽轮枝菌的体外抑菌活性。【结果】托鲁巴姆中克隆获得1个StLTPa7 cDNA序列,该序列含有1个345 bp的开放阅读框,推测编码长114个氨基酸的蛋白,相对分子量为11.42 kD,理论等电点为9.01。StLTPa7受水杨酸（SA）和大丽轮枝菌诱导表达,在处理后24和48 h的表达量较高。为了分析StLTPa7对大丽轮枝菌的抗性,构建了过表达转基因烟草植株,共获得了4个PCR阳性转StLTPa7烟草株系。荧光定量PCR分析显示,该基因在转基因烟草株系L5和L7中过量表达。抑菌试验显示,转基因烟草株系L5蛋白提取物对大丽轮枝菌的抑菌率约为对照的2.5倍。【结论】从野生茄子托鲁巴姆中克隆到1个StLTPa7 cDNA序列,该基因与大丽轮枝菌的生长和增殖的抑制作用相关,可能参与植物对大丽轮枝菌的防卫过程。 相似文献
9.
【目的】克隆短枝型苹果（Malus domestica Borkh.）的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因：MdRGL1a/b、MdRGL2a/b和MdRGL3b。序列分析表明,除MdRGL3b外,另外4条序列都具有DELLA和VHYNP结构域。利用所构建的原核表达载体,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。【结论】短枝型苹果中DELLA蛋白的克隆和原核表达的成功,为进一步纯化和鉴定目的蛋白及研究其功能奠定了试验基础。 相似文献
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苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。 相似文献
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HRAP基因诱导型植物表达载体的构建及烟草转化 总被引：1，自引：0，他引：1
系统获得性抗性是植物抵御病菌侵染的一种独特的防御机制.HRAP基因是一种从甜胡椒中克隆的蛋白质激发子,可以有效引发植物系统性抗性.SAR8.2b基因是烟草系统获得性抗性信号传导途径中下游响应基因,受病原物和水杨酸诱导.本试验根据Genebank发布SAR8.2b基因的启动子序列,利用PCR技术,克隆了SAR8.2b基因的完整启动子,命名为SAR8.2bP,然后将SAR8.2bP构建到pUC18-HRAP载体中命名为pUC18-SAR8.2bP-HRAP,然后用SAR8.2bP-HRAP替换p2300-121载体中的35S启动子和GUS基因,重组子命名p2300-SAR8.2bP-HRAP.将构建的植物表达载体转化农杆菌GV3101,利用叶盘法转化烟草,通过PCR筛选,获得了转基因植株.为进一步验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础. 相似文献
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In plants, the mobile signal for systemic acquired resistance (SAR), an organism-wide state of enhanced defense to subsequent infections, has been elusive. By stimulating immune responses in mosaic tobacco plants created by grafting different genetic backgrounds, we showed that the methyl salicylate (MeSA) esterase activity of salicylic acid-binding protein 2 (SABP2), which converts MeSA into salicylic acid (SA), is required for SAR signal perception in systemic tissue, the tissue that does not receive the primary (initial) infection. Moreover, in plants expressing mutant SABP2 with unregulated MeSA esterase activity in SAR signal-generating, primary infected leaves, SAR was compromised and the associated increase in MeSA levels was suppressed in primary infected leaves, their phloem exudates, and systemic leaves. SAR was also blocked when SA methyl transferase (which converts SA to MeSA) was silenced in primary infected leaves, and MeSA treatment of lower leaves induced SAR in upper untreated leaves. Therefore, we conclude that MeSA is a SAR signal in tobacco. 相似文献
13.
Pepper Phytophthora blight caused by Phytophthora capsici L. is the most destructive disease for reducing pepper yields in the world. Building up varietal resistance and induced resistance to the disease are of agricultural importance. In this paper, the disease resistance induced by salicylic acid (SA) against P. capsici were studied by using four hot pepper lines with different resistant abilities and one P. capsici strain with middle pathogenicity. Results show that SA could induce significantly the resistance of pepper seedlings to P. capsici, but CaC12, KH2PO4 and VAM couldn't. SA at a relative low concentration from 0.15 to 0.3 g L-1 had no antifungal activity in vitro against P. capsici. That means the disease resistant enhancement of the plants treated with SA is due to the induction effect, but not the antifungal effect of SA. About 1 to 5 days internal between SA-treatment and challenge inoculation was sufficient to induce the disease resistance of hot pepper. The resistance could remain more than 20 days after treatment with SA. 相似文献
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【目的】系统获得抗性（system acquired resistance,SAR）是植物抵抗病原菌侵染的一种复杂机制,本研究旨在鉴定大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）诱导的拟南芥系统获得抗性相关的蛋白质。【方法】利用双向电泳分离创伤、水杨酸（Salicylic acid,SA）和大豆疫霉菌诱导的拟南芥叶片的总蛋白,并对28个差异表达的蛋白点进行了MALDI-TOF质谱鉴定。【结果】这28个蛋白点的表达模式可分为3种类型：13个点的表达随着伤口、SA和 P.sojae的诱导而上调;11个点的表达随着伤口、SA和 P.sojae的诱导而下调;4个点在伤口和P.sojae处理中的表达行为与SA处理相反。这些蛋白质涉及了物质代谢酶、调节因子或分子伴侣、氧化还原酶、防御相关蛋白、蛋白激酶、叶绿体蛋白和功能未知蛋白等复杂的生物学功能。【结论】创伤、SA和P.sojae诱导的拟南芥系统获得抗性涉及的抗性组分有很大的重叠,在信号传导网络上也存在一定的交叉。蛋白质组分析为研究复杂的植物抗性机制提供了可行的技术手段。 相似文献
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Harpins是由革兰氏阴性植物病原细菌产生的一类蛋白激发子,对蛋白酶敏感,在非寄主植物叶片上可以诱导hypersensitive response（HR）或hypersensitive cell death（HCD）。HrpNEa是Harpins蛋白的一种,是从梨火疫病菌（Erwinia amylovora）中分离得到的。大量试验证明,HrpNEa蛋白在引起植物过敏反应的同时,能诱导植物获得性系统抗性及刺激植物生长发育。从分子生物学角度,利用国际互联网上的相关生物信息学分析软件NPSA、Swiss-Model、SAPS、InterPro Scan等对HrpNEa蛋白进行了结构和功能的预测分析。HrpNEa蛋白由403个氨基酸组成,有较多的β折叠和无规卷曲结构;HrpNEa蛋白无N端信号肽,不形成跨膜结构,定位于细胞质中。 相似文献
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HarpinXoo是水稻白叶枯病菌分泌的蛋白质，用harpinXoo注射烟草后20 h，可表现过敏性细胞死亡（hypersensitive cell death, HCD）。对harpinXoo诱导的烟草叶片用DNA特异染料（DAPI）染色后经荧光显微镜观察发现，烟草细胞在harpinXoo诱导后不同时间表现明显的染色质浓缩；对诱导后的烟草DNA经2％琼脂糖凝胶电泳发现，诱导后12 h烟草DNA开始出现弥散的条带，24 h后弥散的小片段大量增加；定量RT-PCR检测发现，harpinXoo诱导的烟草HCD早期即有标志基因hin1和hsr203J的诱导表达。这些结果表明，harpinXoo诱导的烟草细胞死亡，是植物的一种主动反应，具有细胞编程死亡的重要特征。 相似文献
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烟草赤星病菌糖蛋白激发子诱导烟草抗病防卫反应 总被引：6，自引：0，他引：6
用来自赤星病菌弱毒株的糖蛋白激发子处理烟草，能明显抑制烟煤草体内过氧化氢酶（CAT）的活性，增加组织中H2O2的含量，诱导后1dCAT活性就已开始下降，至第6天下降到最低，以后又逐渐恢复，而H2O2含量的变化趋势与CAT活性的变化相反，随CAT活性的降低，组织中H2O2含量逐渐增加，在诱导后第10天达到最大值，激发子处理烟草还可以诱导碱性PR蛋白基因PR1b的表达；同时，烟草对赤星病强毒株的抗性逐渐增强，以诱导后第10天接种抗性最强，且这种抗性是系统性的，水杨酸（SA）处理后CAT及H2O2的变化与上述趋势类似。 相似文献
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【目的】β-氨基丁酸（BABA）田间或离体叶片喷洒能够有效诱导马铃薯防卫反应,增强对晚疫病的抗性。研究从组织化学层面进一步探究BABA诱导马铃薯晚疫病抗性过程中诱发的防卫反应及相关信号途径,为深入研究BABA诱导马铃薯产生晚疫病抗性的可能机制奠定基础。【方法】用4 mmol?L-1 BABA或蒸馏水（对照,Mock）喷洒马铃薯植株叶片,3 d后取离体叶片接种晚疫病菌（Phytophthora infestans）,接种后不同时间用打孔器取接种点叶盘用于织化学染色和过敏反应（HR）观察。采用二氨基联苯胺（DAB）组织化学染色方法检测接种点周围活性氧（H2O2）累积情况;叶盘用苯胺蓝（aniline blue）染色,然后在荧光显微镜下观察接种点周围胼胝质积累和表皮细胞HR发生情况;利用干涉了StCOI1（阻断了茉莉酸JA信号传导途径）和超量表达细菌水杨酸羟化酶基因NahG（阻断了水杨酸SA信号传导途径）的转基因马铃薯株系为材料,通过研究BABA能否在这些特殊马铃薯材料上有效诱导晚疫病抗性,进而推断BABA诱导马铃薯晚疫病抗性可能参与的信号途径。【结果】用清水作为空白接种时,Mock和BABA预处理叶片各时间点均未观察到H2O2积累,而病原菌接种处理24 h后,Mock和BABA预处理叶片接种点周围都出现H2O2积累,随着病原诱导时间的延长,H2O2积累增强。但是,BABA预处理叶盘中接种点周围H2O2累积比对照提前12 h,且累积量显著强于对照。苯胺蓝染显示Mock和BABA预处理叶片在接种清水时检测不到胼胝质的沉积,而接种晚疫病菌24 h后,Mock和BABA预处理叶片上均观察到胼胝质的沉积,BABA预处理叶片在侵染点及其附近胼胝质积累量要显著高于对照。荧光显微观察结果显示,BABA预处理和Mock叶片晚疫病接种点周围表皮细胞均有HR发生,BABA预处理叶片早在接种24 h后,接种点周围就已出现HR反应;接种48 h时,BABA预处理85%叶盘的接种点周围表皮细胞出现HR,而Mock叶片只有30%叶盘上观察到HR,BABA预处理叶片HR发生频率比Mock叶片高出55%。BABA不能在超量表达NahG的马铃薯叶片上有效诱发抗性,但能够在干涉了StCOI1的马铃薯叶片上正常诱导产生抗性。【结论】BABA能够从H2O2和胼胝质累积以及HR发生多个层面有效诱发马铃薯基础防御反应,BABA预处理能够在病原菌侵染点周围显著提高胼胝质和H2O2积累水平,诱发接种点发生较高频率的HR,从而提高马铃薯对晚疫病的抗性;BABA诱导马铃薯对晚疫病的抗性依赖水杨酸信号传导途径,但不依赖茉莉酸信号传导途径。 相似文献
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对水杨酸(SA)处理及其挑战接种辣椒疫霉菌的4个抗性不同的辣椒品系体内木质素含量和多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定结果表明:SA诱导的供试品系与未经诱导的相同品系相比,木质素含量增高,PPO、POD、PAL活性增强,其中木质素的含量与抗病性呈显著正相关;挑战接种后两者相比,SA处理的供试材料的木质素含量和PPO、POD、PAL活性的增强幅度更大,其中抗、耐病品系的增加早且增加幅度高于感病、高感品系。值得注意的是,经SA诱导的各供试品系接种后木质素含量与抗病性也呈显著相关。木质素含量与相关酶活性的上述变化趋势与SA对各品系的诱抗效果完全吻合。 相似文献
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植物在与病原物长期相互作用、共同进化过程中产生一系列防卫体系,从而有效地抑制病原物对自身的侵害。当植物受到病原物侵染时,侵染部位通常会在几小时内形成局部细胞死亡,限制病原物的增殖与扩散,称为过敏反应(HypersensitiveResponse,HR)。过敏反应几天或1周后整株植株会对其他病原物产生抗性,称为系统获得性抗性(SystemicAcquiredResistance,SAR)。SAR强调受侵染后植株获得整体抗性的能力,大量研究结果认为SAR是普遍存在的,并具有广谱性。许多研究证实,SA是SAR的重要诱导因子,也是植物受病原菌侵染后活化一系列防卫反应的信号传导途径中的重要组成成分。较为详细论述了SA在诱导植物产生抗病性过程中的作用及其研究进展,另外还对SA在其他抗性方面的作用做了简单的叙述。 相似文献