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【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性；实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达；利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，并进行GO和KEGG富集分析；使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体，并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞，进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系，测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA），转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后，分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况，油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性；miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示，miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达；靶基因预测结果表明，miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）；GO和KEGG功能富集分析发现，miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成，调节脂肪细胞分化，且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol；双荧光素酶报告基因试验结果表明，转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01），但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明，与未分化脂肪细胞（0 d）相比，miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05），到第6天达到极显著差异（P<0.01）；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01），inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）；mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01），inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）；mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05；P<0.01），inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）；油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进猪前体脂肪细胞成脂分化。 相似文献
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【目的】 本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制。【方法】 分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物（mimic）、抑制物（inhibitor）后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA）3'-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低（P<0.01）,BCL2基因的表达量极显著增加（P<0.01）;抑制miR-145-4后,CyclinB2基因表达量极显著升高（P<0.01）,BCL2基因表达量极显著降低（P<0.01）。预测结果显示,miR-145-4与PIK3CA基因3'-UTR存在结合位点。PCR扩增和测序结果显示,PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型载体构建成功。双荧光素酶检测结果显示,与突变型及空载体共转染组相比,野生型组双荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,说明miR-145-4能够与PIK3CA基因3'-UTR结合。实时荧光定量PCR结果表明,在蛋鸭卵泡颗粒细胞中过表达miR-145-4后,PIK3CA基因表达量显著降低（P<0.05）,而抑制miR-145-4后,PIK3CA基因表达量极显著升高（P<0.01）。【结论】 miR-145-4通过正向调控靶基因PIK3CA促进蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡,进而调控蛋鸭的卵泡发育。 相似文献
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旨在分析miR-138在牦牛前体脂肪细胞分化过程中的调控作用。本研究设计合成miR-138 mimics和inhibitor以对细胞进行miR-138过表达及抑制表达,并通过油红O染色分析miR-138对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响;利用CCK-8、划痕和流式细胞技术分析miR-138对细胞增殖的影响;通过对bta-miR-138进行生物信息学分析,筛选其在脂质沉积过程中的相关潜在靶基因;利用RT-qPCR测定miR-138潜在靶基因mRNA表达水平,并通过双荧光素酶报告试验确定靶向关系。结果显示,过表达miR-138后,细胞内脂滴沉积水平显著低于对照（NC）组（P<0.01）,而抑制miR-138表达则显著增强脂肪细胞脂质沉积（P<0.01）;RT-qPCR结果表明,过表达miR-138可显著抑制脂肪分化标志基因PPARγ和c/EBPα的表达（P<0.01）,抑制miR-138则上调PPARγ和c/EBPα表达水平（P<0.05）;此外,过表达miR-138后,潜在靶基因PTPN11、CREB1和ADCYAP1R1表达水平显著下调（P<0.05）,而PGC-1α和SNAP25表达极显著下调（P<0.01）;抑制miR-138后MXLIP和SNAP25表达显著上调（P<0.05）,PGC-1α和PTPN11表达极显著上调（P<0.01）;CCK-8和划痕试验结果表明,过表达miR-138后24~36 h,细胞增殖活性显著低于对照组（P<0.05）,而抑制miR-138则表现为细胞增殖活性增强;流式分析结果显示过表达miR-138后,细胞出现G1-S期阻滞,细胞周期相关基因CCND1、CCNB1和增殖标志基因Ki67的mRNA表达显著降低;生物信息学分析预测获得263个miR-138公共靶基因,KEGG富集结果显示靶基因主要参与“轴突导引”、“胰岛素抵抗”、“胰岛素分泌”及“RNA降解”等通路,GO分析主要富集于“RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控”、“核染色质”、“染色质DNA结合”和“I型肺细胞分化”等功能;双荧光素酶报告试验结果显示,共转染miR-138 mimics和PGC-1α-Wt-PGL3-basic可显著降低细胞荧光强度（P<0.01）。以上结果表明,miR-138可通过靶向结合PGC-1α 3'UTR序列,降低PGC-1α的mRNA表达水平,抑制牦牛肌内前体脂肪细胞分化和脂质沉积,降低细胞增殖活性。本研究为阐明牦牛肉质性状的潜在分子机制提供参考。 相似文献
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旨在筛选并验证调控牛增强子结合蛋白A（CCAAT/enhancer binding protein alpha，CEBPA）表达的miRNA及其对肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响。本研究综合运用多个在线软件筛选与CEBPA基因具有潜在调控关系的miRNA，运用qRT-PCR技术检测CEBPA基因在关岭牛各类组织中的表达水平；构建CEBPA-3'UTR-WT和CEBPA-3'UTR-MUT双荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶报告系统验证候选miRNA与CEBPA基因的结合关系；分离培养关岭牛肌内前体脂肪细胞，利用qRT-PCR、Western blot、油红O染色和CCK-8探究调控CEBPA的miRNA对牛肌内前体脂肪细胞分化与增殖的影响。生物信息学分析发现，bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a、bta-miR-181b、bta-miR-181c、bta-miR-181d与CEBPA基因具有潜在结合关系；qRT-PCR结果表明，CEBPA基因在关岭牛内脏组织、肌肉组织、脂肪、下丘脑以及部分生殖器官中均有表达，在2岁牛背最长肌的表达量极显著高于1日龄犊牛（P<0.01）；双荧光素酶报告系统结果表明，bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能直接结合牛CEBPA基因3'UTR；细胞试验结果表明，CEBPA基因在牛肌内前体脂肪细胞分化中的表达水平随时间逐渐升高，bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a在分化0 d表达水平极显著高于其他时期（P<0.01），整个分化时期bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a与CEBPA基因表达趋势相反；过表达miR-23a、miR-23b-3p、miR-181a均能极显著降低CEBPA基因mRNA和蛋白表达量（P<0.01），并降低牛肌内前体脂肪细胞中脂滴含量；bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能阶段性促进细胞增殖。结果表明，bta-miR-23a、bta-miR-23b-3p、bta-miR-181a能阶段性的促进牛肌内前体脂肪细胞增殖，并通过直接负调控CEBPA的表达来间接影响该细胞分化。 相似文献
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旨在探究bta-miR-677调控Ⅰ型干扰素（IFN）表达的分子机制。将bta-miR-677转染MDBK细胞,检测Ⅰ型IFN和干扰素刺激基因（ISGs）的转录水平;随后通过TargetScan预测bta-miR-677的靶基因,双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot验证bta-miR-677的靶基因;利用siRNA敲减验证靶基因对Ⅰ型IFN转录的影响。结果显示,过表达bta-miR-677组IFN-α/β的转录水平高于对照组2~4倍（P<0.001）,随后检测到6种ISGs（IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2）转录量上调2~16倍（P<0.01或P<0.001）;反之,抑制表达bta-miR-677组IFN-α/β转录量下调（P<0.01或P<0.05）,同时IFI6、OAS1Y、OAS1Z、RSAD2、MX1和MX2转录量下调（P<0.05或P<0.01）。经TargetScan预测和双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot检测显示,bta-miR-677可靶向结合线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）的3'-UTR,抑制MAVS蛋白的表达;MAVS基因敲减后发现,IFN-α、IFN-β和6种ISGs转录量上调。研究结果表明,bta-miR-677通过靶向MAVS上调IFN-α/β转录水平,进而提高ISGs的表达量,为基于bta-miR-677研制抗病毒药物提供了重要资料。 相似文献
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【目的】 探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞（RAW264.7）自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】 首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物（miR-145a-3p mimics）和抑制剂（miR-145a-3p inhibitor）及对照模拟物（NC mimics）,转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因（autophagy-related gene 14,ATG14）的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响。【结果】 miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3'UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3'UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低（P<0.01）。与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低（P<0.01）、ATG14蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）,miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调（P<0.01）;布鲁氏菌感染后,miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高（P<0.01）,且miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+Bru组（P<0.05）。miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平。miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低（P<0.05）。【结论】 miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制。 相似文献
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【目的】 克隆多浪羊C型利钠肽(CNP)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在多浪羊初情期启动前后下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中的表达规律,以期为研究CNP基因在多浪羊初情期启动过程中的作用机制提供参考。【方法】 参考GeneBank中绵羊CNP基因的序列(登录号:XM_027974523.1)设计引物,以初情期前、初情期、初情期后的多浪羊为试验对象,采用RT-PCR技术扩增多浪羊CNP基因并进行克隆测序;用DNAMAN软件同其他物种进行相似性比对,并使用Mega 5.0构建系统发育树。用生物信息学软件分析CNP基因的核苷酸序列及其编码蛋白的疏水性、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域等理化性质和二级结构、三级结构信息;用实时荧光定量PCR技术检测多浪羊下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中CNP基因的表达量。【结果】 多浪羊CNP基因序列大小为2 227 bp,其中包括5'-UTR 50 bp、3'-UTR 914 bp和CDS区1 263 bp。相似性比对和系统发育树结果显示,多浪羊与山羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;多浪羊CNP基因共编码420个氨基酸,其编码蛋白是亲水性蛋白质,无跨膜结构域和信号肽。多浪羊CNP蛋白的二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲;三级结构预测显示CNP蛋白无配体结构;实时荧光定量PCR结果显示,在初情期启动的3个发育阶段,下丘脑中CNP基因表达量显著高于其他组织(P<0.05);初情期下丘脑中CNP基因的表达量显著低于初情期前(P<0.05);子宫中初情期前CNP基因的表达量显著高于初情期和初情期后(P<0.05)。【结论】 本研究成功克隆了多浪羊CNP基因,其主要在下丘脑和子宫中表达;在初情期前、初情期、初情期后的发育过程中,下丘脑组织中CNP基因的表达量先降低再升高,提示CNP基因可能在初情期的启动过程中参与调控。 相似文献
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【目的】 探讨microRNA-188-5p （miR-188）在乳腺癌细胞增殖、迁移和凋亡过程中的调控作用，以期为乳腺癌相关治疗药物的研发提供理论依据。【方法】 培养小鼠乳腺癌细胞（4T1），建立4T1细胞小鼠移植瘤模型，分离肿瘤组织和瘤旁组织，用实时荧光定量PCR法检测miR-188的表达情况；在4T1细胞中分别转染miR-188的模拟物（miR-188 mimics）、模拟物对照（mimics-NC）、miR-188抑制物（miR-188 inhibitor）及抑制物对照（inhibitor-NC），不转染的细胞为空白对照（Con），用实时荧光定量PCR法检测各组细胞miR-188的表达水平，CCK-8法检测细胞增殖能力，细胞划痕试验检测细胞的迁移率，流式细胞术检测细胞的凋亡率，Western blotting检测细胞相关凋亡蛋白的表达情况。【结果】 瘤旁组织中miR-188的相对表达量显著高于肿瘤组织（P<0.05）；细胞转染结果表明，与Con组相比，miR-188 mimics组miR-188的相对表达量显著上调（P<0.05），而miR-188 inhibitor组显著下调（P<0.05），mimics-NC、inhibitor-NC组均无显著差异（P>0.05），因此后续试验分别以mimics-NC、inhibitor-NC为miR-188 mimics、miR-188 inhibitor的对照进行分析。细胞增殖和划痕试验结果表明，与mimics-NC组相比，miR-188 mimics显著降低4T1细胞的增殖速率和迁移速率（P<0.05）；细胞凋亡试验结果显示，与mimics-NC组相比，miR-188 mimics显著促进4T1细胞凋亡（P<0.05）；与inhibitor-NC组相比，miR-188 inhibitor显著抑制细胞凋亡（P<0.05）；Western blotting结果表明，miR-188 mimics显著降低基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白的表达水平（P<0.05），显著提高聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP1）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和Bcl-2-associated X蛋白（Bax）的表达、抑制抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的表达（P<0.05）。【结论】 miR-188可显著抑制4T1细胞的增殖和迁移，促进4T1细胞凋亡，说明miR-188可以作为抑制乳腺癌进展和转移潜能的肿瘤调节子。 相似文献
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【目的】 试验旨在研究多形性腺瘤基因1（plemorphic adenoma gene 1,PLAG1）基因序列特征、多态性以及对山羊出生体重、体尺的影响。【方法】 以波尔山羊为研究对象,克隆PLAG1基因序列并测序,采用实时荧光定量PCR鉴定其在不同年龄和体重波尔山羊组织中的表达模式,采用Western blotting方法检测PLAG1在不同体重羔羊腿肌中的表达水平,进一步筛选PLAG1基因CDS和3'-UTR区SNP,并分析各位点不同基因型与波尔山羊出生体重、体尺的相关性。【结果】 波尔山羊PLAG1基因CDS全长1 500 bp,编码499个氨基酸,PLAG1蛋白相对保守。组织表达谱显示,PLAG1基因在出生体重较大的羔羊心脏、小肠和腿肌中表达水平显著或极显著高于出生体重较小的羔羊,在胎羊各组织中mRNA表达水平均显著或极显著高于成年母羊（P<0.05;P<0.01）;PLAG1蛋白在出生体重较大的羔羊腿肌中表达量极显著高于出生体重较小的羔羊（P<0.01）。在波尔山羊PLAG1基因3'-UTR区共筛选到6个SNPs位点,分别为：2664 A>G、2712 A>G、2721 T>C、2879 T>A、2990 A>T和3270 A>G。关联分析发现,2664 A>G位点AG基因型个体出生管围显著大于GG基因型（P<0.05）;2721 T>C位点TT基因型个体出生体长显著大于TC基因型（P<0.05）;2879 T>A位点TA基因型个体出生管围显著大于AA基因型（P<0.05）;2990 A>T位点AA基因型个体出生体重显著高于AT基因型（P<0.05）;3270 A>G位点GG基因型个体出生体长显著大于AA基因型,AG基因型个体出生胸围显著大于AA基因型（P<0.05）。【结论】 PLAG1基因在波尔山羊胎羊各组织中表达水平均高于成年母羊,发育早期的表达水平与出生羔羊体重相关。PLAG1基因可作为分子标记用于波尔山羊早期生长选育。 相似文献
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【目的】 探究对牛骨骼肌发育具有调控作用的长链非编码RNA （long non-coding RNA,lncRNA）,研究其在牛骨骼肌卫星细胞增殖期和分化期的表达量变化,为牛肌肉发育相关机制方面的研究提供参考依据。【方法】 选取实验室前期高通量测序获得的1条lncRNA （lnc721）,通过NCBI数据库和CPC网站分析其生物学信息并预测其编码能力,通过核质分离试验确定其亚细胞定位。设计并合成lnc721的siRNA转染牛骨骼肌卫星细胞,通过成熟的体外成肌细胞诱导分化模型培养牛骨骼肌卫星细胞并进行诱导分化。分别采用EdU试验、实时荧光定量PCR和Western blotting分析lnc721在细胞发育不同时期表达量的变化情况。【结果】 lnc721位于牛全基因组的18号染色体上,其蛋白编码能力为―1.33129,主要定位于细胞质内。在干扰lnc721表达量后发现,EdU阳性细胞比率极显著上升,细胞增殖标志因子Pax7和Ki-67基因的mRNA表达水平极显著上调（P<0.01）;Western blotting结果进一步证明,干扰lnc721后极显著促进了Pax7蛋白的表达（P<0.01）,在细胞分化期干扰lnc721表达后,细胞分化标志因子MyHC基因的mRNA和蛋白表达水平均极显著下调（P<0.01）。【结论】 干扰lnc721表达可促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖并抑制成肌分化进程。 相似文献
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【目的】研究miR-140-5p在前脂肪细胞（3T3-L1）成脂分化过程中的功能及其作用机制。【方法】待3T3-L1细胞汇合度达100%时诱导其成脂分化，收集分化第―1（诱导分化前1 d）、0、1、2、3、5、7天的细胞，用实时荧光定量PCR检测miR-140-5p相对表达量；将miR-140-5p mimics、NC转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）、CAAT增强子结合蛋白δ（C/EBPδ）与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）相对表达量；利用miRandn和TargetScan在线网站预测miR-140-5p的靶基因；通过对比序列差异分析P300/CBP相关因子（PCAF）的3'-UTR序列中与miR-140-5p的结合位点序列在小鼠、人等不同物种间的序列保守性。将miR-140-5p mimics、inhibitor、NC转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化，实时荧光定量PCR检测miR-140-5p、PCAF相对表达量，Western blotting检测PCAF蛋白水平；将PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1转染3T3-L1细胞，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测PCAF、C/EBPδ、PPARγ基因相对表达量，Western blotting检测C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ蛋白表达水平。将3条PCAF siRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）、siRNA NC转染3T3-L1细胞，Western blotting法检测PCAF蛋白水平，筛选最佳PCAF siRNA。将最佳PCAF siRNA和siRNA NC转染3T3-L1细胞，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ与PPARγ基因相对表达量，Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ蛋白表达水平。分别将miR-140-5p mimics、NC与PGL0-PCAF 3'-UTR载体和PGLO空载体共转染293T细胞，用双荧光素酶报告试验检测miR-140-5p与PCAF的靶向关系。【结果】在诱导3T3-L1细胞成脂分化过程中，与诱导分化前1 d相比，在细胞成脂分化第1、2天时miR-140-5p相对表达量极显著升高（P＜0.01），在分化第3天时显著升高（P＜0.05）。与NC组相比，miR-140-5p mimics组脂滴数量明显增加，miR-140-5p mimics组成脂标志基因C/EBPδ与PPARγ相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。靶基因预测结果表明，miR-140-5p与PCAF存在预期结合位点；保守性分析结果表明，靶基因PCAF结合位点序列在不同物种间具有高度保守性。与NC组相比，mimics组miR-140-5p和PCAF相对表达量均极显著升高（P＜0.01），inhibitor组miR-140-5p极显著降低（P＜0.01）、PCAF显著降低（P＜0.05），PCAF蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。与PEGFP-N1组相比，PEGFP-N1-PCAF组脂滴数量增多，PCAF、PPARγ基因相对表达量和C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平极显著升高（P＜0.01），PPARγ蛋白水平显著升高（P＜0.05）。PCAF siRNA1、siRNA2与siRNA3均极显著抑制PCAF蛋白的表达（P＜0.01），siRNA3的效果最显著，因此选择siRNA3进行后续试验。与NC组相比，PCAF siRNA3组3T3-L1细胞中脂滴数量较少，PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因相对表达量和C/EBPβ蛋白水平均极显著下降（P＜0.01）。双荧光素酶报告试验结果显示，miR-140-5p与PCAF基因之间无靶标关系。【结论】内源性miR-140-5p在3T3-L1细胞分化过程中表达升高，miR-140-5p可能通过间接上调PCAF基因表达促进3T3-L1细胞成脂分化。 相似文献