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以芥菜(Brassica Juncea Coss.)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的介导,将商陆抗病毒蛋白（PAP）基因导入到芥菜中。对所获得的40株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为29株;Southern blot分析结果证明PAP基因已被整合到芥菜基因组中,在大多数转基因植株中外源基因呈单挎贝,少数为双挎贝;Northern blot分析结果表明,PAP在转基因植株中正常表达。转基因植株接种病毒试验初步结果表明,转PAP基因的植株对TuMV的侵染有一定的抑制作用。 相似文献
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李汉霞;尹若贺;陆芽春;张俊红 《农业生物技术学报》2006,14(4):546-550
以结球甘蓝（Brassica oleracea var. capitata ）下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciecin）介导法将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）杀虫蛋白基因CryIA(c)导入结球甘蓝栽培品种中，共获得56株卡那霉素抗性植株。分别以CryIA(c)和NPTⅡ基因引物进行PCR扩增，结果43株均扩增出了预期的目的带。以CryIA(c)基因为探针，进行Southern blot分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中，且多数转基因植株只含有单拷贝的外源基因。离体叶片抗虫实验表明，转基因植株幼虫校正死亡率为40%，平均单虫重达到极显著水平，叶片损害程度差异明显，转基因植株抗性较对照显著提高。通过卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增两种方法鉴定，表明外源基因在转基因甘蓝自交后代呈孟德尔单基因遗传。 相似文献
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以结球甘蓝（Brassica oleracea var．capitata）下胚轴为外植体，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciecin）介导法将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫蛋白基因CryIA（c）导入结球甘蓝栽培品种中，共获得56株卡那霉素抗性植株。分别以CryIA（c）和NPTⅡ基因引物进行PCR扩增，结果43株均扩增出了预期的目的带。以CryIA（c）基因为探针，进行Southern blot分析，证明外源基因已经整合到甘蓝基因组中，且多数转基因植株只含有单拷贝的外源基因。离体叶片抗虫实验表明，转基因植株幼虫校正死亡率为40％，平均单虫重达到极显著水平，叶片损害程度差异明显，转基因植株抗性较对照显著提高。通过卡那霉素涂抹叶片和PCR扩增两种方法鉴定，表明外源基因在转基因甘蓝自交后代呈孟德尔单基因遗传。 相似文献
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转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。 相似文献
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利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数 总被引：8，自引：0，他引：8
微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一种基于泊松分布原理的核酸分子绝对定量技术,在核酸分子的绝对计数/定量领域具有极大的应用潜力。本研究基于ddPCR平台,以转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19和转人乳铁蛋白基因基因山羊(Capra hircus)134为例,建立了转基因生物(genetically modified organisms,GMOs)外源基因拷贝数分析方法,并比较了其与传统的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Southern blot方法的准确性。实验数据表明,T1c-19的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein,Cry1C*)在qRT-PCR和ddPCR测定结果比较一致,约为2拷贝,但已报道的Southern blot分析结果为1拷贝;ddPCR对bar基因的分析结果高于qRT-PCR,分别为2.09拷贝和1.51拷贝。转人乳铁蛋白基因(human lactoferrin,HLF)山羊134在qRT-PCR和ddPCR的分析结果基本一致,均测得含有1拷贝的HLF基因。研究结果表明,微滴数字PCR方法是一种经济、快速和准确的外源基因拷贝数分析新方法,灵敏度和准确性高,将会在拷贝数分析中广泛应用。 相似文献
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以本实验室构建的重组南瓜(Cucurbita moschata)韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBdENP。利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种Favorita，经过抗生素筛选，共获得转pBdENP和对照pBI121的抗卡那霉素马铃薯再生植株106株。通过PCR初步筛查，筛选出65株为转基因阳性植株。通过Southern blot对部分植株进一步分析,确证外源gus基因已经插入到转基因马铃薯植株的基因组中，插入拷贝数在1个或2个以上。对这些转基因马铃薯植株进行GUS染色结果表明, dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动gus基因的表达，前者仅在马铃薯的韧皮部内特异表达，而CaMV35S启动子驱动的gus基因为组成型性表达。GUS酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动gus基因表达水平没有明显区别。以上结果证明dENP启动子驱动的外源基因在马铃薯中也具有韧皮部特异而高效表达的特征，从而可用于马铃薯抗病、抗蚜虫转基因研究。 相似文献
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为进一步明确外源基因在转基因柑橘无性繁殖后代中的遗传稳定性及目标性状表现,本研究以转双价抗菌肽基因(ShivaA-cecropinB)纽荷尔脐橙(Citrus Sinensis Osbeck)无性繁殖后代植株为材料,通过PCR扩增,Southern杂交和实时定量PCR检测,以及温室抗病性评价分析等,对抗菌肽ShivaA基因在转基因柑橘后代株系中的遗传稳定性进行了研究.结果表明,外源抗菌肽Shiva A基因在转基因及其无性后代中能够稳定整合与表达.Southern杂交分析表明,ShivaA基因在无性繁殖后代基因组中为1个拷贝,而在T0代中为2个拷贝,由此推测T0代植株为混合嵌合体.定量PCR分析表明,ShivaA基因在To代中的表达水平低于其无性繁殖后代.本研究中外源基因的表达与拷贝数的多少成负相关.研究结果为开展转基因柑橘安全性评价提供了有用的实验材料,积累了有效的实验数据. 相似文献
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甘蔗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGPase)转化拟南芥及转基因植株的生理特性分析 总被引：3，自引：0，他引：3
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)是植物糖代谢的主要参与酶之一,在植物的生长发育过程中起着重要作用。本研究将甘蔗(Saccharum officinarum)UGPase基因cDNA片段连接至载体pBI121,通过BamHⅠ和SacⅠ酶切鉴定及测序验证,结果表明,植物表达载体成功构建;通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,采用浸花法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。结合卡那霉素抗性筛选和PCR检测,获得了5株T0代转基因植株。对T1代转基因植株进行PCR及Southern blot分析,结果表明,目的基因已成功转入拟南芥中,并且不同的转化植株含有目的基因的拷贝数不同。对T2代转基因植株进行PCR和RT-PCR检测,结果表明,目的基因不仅能在自交系后代中稳定遗传,而且在RNA水平也有表达。同时,对T2代转基因植株的可溶性总糖、蔗糖及淀粉含量进行测定,结果表明,与野生型相比,转基因植株中可溶性总糖含量没有明显的变化,但蔗糖含量有所提高,并且差异明显,比野生型植株提高了50.85%~96.99%,而淀粉含量都较野生型植株的低,降低了9.69%~36.76%。说明UGPase在蔗糖与淀粉的转换过程中起着较为重要的作用,其催化的反应方向影响着组织中这两种产物(蔗糖和淀粉)的分配。 相似文献
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《核农学报》2010,24(3):482-489
根据GenBank中Lyc-β基因 (X86452) 及Lyc-ε基因 (Y14387) 设计引物,通过高保真PCR从番茄cDNA中克隆到两段长度为302 和330bp的Lyc-β基因片段和两段长度为302 和288bp的Lyc-ε基因片段。从质粒pCAMBIA-2301 (AF234316) 克隆出gusA基因长度为168 和235bp的2个内含子片段。根据RNAi原理将正、反向序列与内含子连接,之后插入启动子与终止子之间构建成4组植物表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草植株,通过PCR鉴定共获得107株转基因植株。利用荧光定量PCR分析干扰效果,结果显示经4组干扰载体干扰后,转基因植株中目的基因mRNA含量分别为对照的3.4%、16.4%、15.2%和21.8%。进一步用HPLC对应分析转化株的番茄红素含量,结果表明转基因植株中番茄红素平均增长量分别为3.4、2.1、3.4和2.0μg/g。同时测定转基因植株中的β-胡萝卜素与叶黄素含量,发现它们根据干扰的基因不同呈现对应的变化。 相似文献
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将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白(VHb)基因(vgbM)与含有融合杀虫基因(GFMcryIA和CPTI)表达载体pGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体pGBIF4ABCVHB,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草(Nicotiana tabacum),经PCR及Southernblot检测,证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。Westernblot检测证实了vgbM基因的表达,杀虫实验表明,融合杀虫基因表达的毒蛋白具有杀虫活性,转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8%。表明VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达可使烟草可增产,又具抗虫性。 相似文献
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人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究 总被引：4，自引：0，他引：4
利用经密码子优化的、人工合成雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin),gna基因及RbcS启动子构建了高效特异表达载体pBAC202,通过基因枪轰击小麦幼胚和幼穗,将外源gna基因导入到3个高产小麦(TriticumaestivumL.)品种中,获得42个转基因后代株系。对转基因后代植株进行了DNA点杂交、PCR及PCR-Southern验证,确认外源gna基因已成功地整合到小麦基因组中。进一步的凝集素活性检测表明,小麦叶片中表达的凝集素可使红细胞凝集,并具有正常的生物学活性。转基因植株在人工饲养条件下进行抗蚜虫(Rhopalosiphumpadi)试验,蚜口密度抑制率从19%～73%不等,部分株系抑虫效果较好。利用转基因的方式可将外源抗虫基因gna导入到小麦中,并可有效地增强小麦的抗蚜能力,为选育具抗虫特性的优质小麦提供新的途径。 相似文献
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陈银华 《农业生物技术学报》2007,15(3)
筛选番茄幼苗cDNA文库获得与番茄抗性相关的克隆E11，设计引物，利用RT-PCR方法从受到病原浸染的番茄叶片中获得长1018 bp的候选片段，同源性分析发现该片段与其他作物上已发表的ACO基因序列高度同源：同源率从83%~99%，推断该基因为番茄ACO基因家族的新成员。在此基础上，用BP克隆的方法构建该基因的RNA干涉（RNAi）载体pD311，对番茄进行遗传转化，获得卡那霉素抗性植株27棵，分子检测证实外源片段成功导入其中番茄基因组中。对获得的转基因植株的乙烯生成量测定结果表明，RNAi结构的导入大大抑制了内源ACO基因的表达，从而导致乙烯的生成大大降低。 相似文献
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由根癌农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因转入水稻 总被引：28，自引：0，他引：28
摘要:将具有广谱抗病作用的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase , GO）基因插入具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，新构建了水稻高效表达载体pCAG1301。将此质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）菌株LBA4404后,转化粳稻(Oryza. sativa L.ssp.japonica )品种日本晴(Nipponbare)的幼胚，并由筛选出的潮霉素抗性愈伤组织分化再生植株。对所得潮霉素抗性水稻植株的Southern杂交分析表明，GO基因已整合到受体基因组。淀粉-碘化钾显色反应检测到了转基因植株产生的过氧化氢，证实GO基因表达产生的葡萄糖氧化酶已经在水稻中发挥功能。抗病性鉴定表明，所得转基因水稻对稻瘟菌(Magnaporthe grisea )具有良好的抗性。 相似文献
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germin基因的克隆及其在烟草中的表达 总被引：4，自引：0，他引：4
摘要：克隆了具有草酸氧化酶活性的小麦(Triticum aestivum )Germin蛋白的基因，构建了植物表达载体并用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )介导法转化烟草。Southern杂交和酶活性检测表明，germin基因在转基因烟草(Nicotiana tabacum )中得到整合、表达，并正确组合成具有草酸氧化酶活性的同源六聚体蛋白。离体实验表明，外源germin基因的表达提高了转基因烟草离体叶片对草酸的耐受性。 相似文献
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王友如 《农业生物技术学报》2007,15(6)
将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（VHb）基因与含有融合杀虫基因（GFMcryIA基因和CPTI基因的融合）表达载体PGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体PGBIF4ABCVHB，通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了38株卡那霉素抗性转基因株，经PCR及Southern blotting检测，证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。western blot检测证实了VHb基因的表达,杀虫实验表明融合杀虫基因表达出的毒蛋白具有杀虫活性，转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8％。实验结果表明：VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达既可使烟草既可增产、又具抗虫性。 相似文献
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