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1.
为筛选青枯菌M5菌株特有的序列,利用SSH技术对青枯菌生理小种5号菌株M5（tester）和生理小种1号菌株GMI1000（driver）基因组进行了比较。分别提取二者基因组DNA,RsaⅠ酶切,将酶切后M5菌株DNA分为两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR扩增,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物,即差异基因/差异DNA片段,与pGEM-T载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,建立消减文库。随机挑取96个白色克隆,经菌液PCR法测定,80个为预期阳性,含有预期的插入片段。首次构建了青枯菌M5菌株特异基因的抑制消减文库,为进一步筛选、克隆青枯菌M5菌株特异核苷酸片段奠定了基础。 相似文献
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为了解鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的基因组差别,筛选鸡白痢沙门氏菌特有的序列,利用SSH对鸡白痢沙门氏菌C79-13（实验方）与鸡伤寒沙门氏菌Sg9（驱动方）基因组进行了比较。选择四碱基内切酶Rsa I将C79-13与Sg9基因组DNA酶切,酶切的C79-13基因组DNA分成两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR ,得到消减混合物, 将其与PCR?2.1克隆载体连接,转化感受态E.coli DH5α建立消减文库。结果共获得400个阳性克隆;筛选240个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2000 bp大小的片段。差异DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆鸡白痢沙门氏菌特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。 相似文献
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基于抑制消减杂交开发长穗偃麦草(Lophopyrum elongatum)特异分子标记 总被引：2，自引：0，他引：2
分别以二倍体长穗偃麦草和普通小麦中国春的基因组DNA作实验组和对照组,运用抑制消减杂交(SSH)技术去除2个基因组DNA之间的同源序列, 获得长穗偃麦草特异的DNA片段构建的单向抑制消减文库,并对随机克隆测序。根据测序结果设计引物,获得36个长穗偃麦草基因组特异分子标记,成功率高达69.2%。这些标记均能在具有长穗偃麦草E染色体的不同小麦背景和不同世代中稳定表现,可用于小麦背景中跟踪长穗偃麦草染色体或片段。 相似文献
5.
用磁珠富集法分离亚麻基因组微卫星分子标记 总被引：5，自引：0，他引：5
应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(CT)15与亚麻基因组DNA酶切片段杂交,捕获300~1 500 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。利用接头引物和根据微卫星核心序列设计的引物VRV(CT)15使用PCR方法直接对文库筛选,从422个转化子中获得了104个阳性克隆,对其进行测序分析,获得了97个微卫星序列,微卫星序列的富集效率达到22.99%,PCR扩增筛选效率93.27%。对97个微卫星序列进行比对分析,其中51个重复序列的两端序列高度相似,据其设计的特异引物对阳性克隆进行2次筛选,能淘汰相似度高的同类序列,提高筛选亚麻微卫星标记的效率。 相似文献
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与水稻K型细胞质雄性不育性特异的mtDNA片段的鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
水稻K型雄性不育材料是新发现的一类核质互作不育类型.本研究以水稻K型雄性不育的不育系(K17A)、保持系(K17B)以及杂交F1代(K优17)为研究对象.采用SDS法提取各水稻材料的线粒体DNA(mtDNA),mtDNA经纯化后利用EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ进行双酶切,并进行AFLP分析.利用AFLP分子标记技术从上述材料的mtDNA中找到了K17A、K优17所共有的特异片段,回收并纯化该片段.特异片段经克隆测序后,得知该特异片段序列为442 bp所组成.利用GenBank对其进行序列对比分析,表明该序列与水稻其他已知核质互作不育类型特异片段序列不相关,并且该序列与水稻的两种未知功能蛋白的表达相关. 相似文献
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以辣椒细胞质雄性不育系21A及其保持系21B的线粒体DNA为材料进行SRAP分析,结果表明,从128对引物扩增获得了1 440条100～1 000 bp的条带,多态性位点仅有9个,占0.63%,其中7条多态性条带位于21A中;对多态性条带回收、克隆和测序分析后发现,9个克隆在GenBank中找到了相似的功能,绝大部分与能量代谢有关;利用21A中的多态性序列特点设计SCAR引物,对21A和21B的基因组DNA进行扩增验证,3对引物在21A中扩增出目的条带,表明已成功地将SRAP标记转化为SCAR标记,是新发现的与辣椒细胞质雄性不育基因相关的片段。 相似文献
8.
《分子植物育种》2015,(7)
中国用于杂交粳稻生产的细胞质雄性不育系仅有滇Ⅰ型和BT型,它们的不育系产生的花粉都为染败型,而且具有相同的恢保关系、同为配子体不育。因此,基于花粉败育特点和恢保关系等常规技术无法鉴别这两种不育系。本研究利用线粒体特异引物LD24对27个滇Ⅰ型不育系和9个BT型不育系进行PCR扩增,结果显示滇Ⅰ型不育系无扩增片段,BT型不育系具有1个605 bp的片段。该片段的DNA序列与水稻LD型雄性不育细胞质线粒体基因组的一个604 bp片段相似性达99%,该片段包括一个位于rps1基因下游的一段230 bp序列及rps1与orf187基因间隔区上游的一个374 bp序列。本研究的结果说明利用LD24标记的PCR产物可以有效地鉴别水稻滇Ⅰ型和BT型雄性不育细胞质。 相似文献
9.
‘安吉白茶’抑制消减杂交cDNA文库的构建及初步分析 总被引：3，自引：1，他引：2
应用抑制消减杂交技术（Suppression subtractive hybridization,SSH）分离‘安吉白茶’全白期与全绿期叶片差异表达基因,成功构建了‘安吉白茶’白期叶与绿期叶的正、反向消减文库。随机挑选80个阳性克隆测序,通过BLASTX比对分析,80个序列中有30个没有找到任何同源序列,8个序列太短,且同源性不高,42个序列与已知蛋白有着或高或低的同源性。其中有3个基因片段可能与‘安吉白茶’高氨基酸形成相关。 相似文献
10.
基于ISSR和AFLP标记开发甜菜 SSR 引物的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究以ISSR-PCR和AFLP标记原理为基础,介绍一种新的分离甜菜基因组微卫星引物的方法。首先对甜菜基因组DNA进行酶切并连接已知序列的接头,构建基因组DNA酶切文库,同时用一个或两个ISSR引物,扩增文库中两端含微卫星序列片段并进行克隆测序,根据测序结果设计微卫星序列间的IP1引物和IP1与微卫星序列间IP2 引物;再根据侧翼序列克隆原理,采用巢式PCR进行基因组步移,扩增IP2引物下游序列,根据巢式PCR产物测序结果,设计微卫星序列另一侧的引物IP3 ,IP2和IP3即为SSR标记引物,对获得的SSR引物进行PCR验证,结果表明SSR引物产率为16%,本研究获得的SSR引物具有较高的多态性,对于后续的遗传多样性检测和遗传连锁图构建具有重要意义。 相似文献
11.
利用抑制差减杂交技术分离棕色棉纤维特异表达基因 总被引：2，自引：1，他引：1
采用棕色棉新彩棉5号为Tester,其白色近等基因系NIL-C5为Driver,通过抑制差减杂交法(suppressive subtractive hybridization,SSH)构建了一个棕色棉纤维色素差异表达基因差减文库.从文库中随机挑选400个克隆,将这些克隆的PCR产物点膜进行反向Northern杂交检测,挑选20个差异明显的克隆进行序列分析,结果表明:有5个cDNA片段与已知的功能基因序列相似,其中1个cDNA片段与合成色素的重要酶基因4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)基因有较高的同源性,其它cDNA片段在数据库中未找到同源序列. 相似文献
12.
小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础。试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(EDTA-Fe2＋,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2＋,40 μmol/L)的根的总RNA,经过LD-PCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库。用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300~800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果。 相似文献
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以抗花叶病毒病品系东农8143为材料,利用抑制消减杂交技术构建了一个大豆花叶病毒接种初期的cDNA文库,共获得2000个阳性克隆。随机挑取64个阳性克隆测序,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比较,其中49个有比较明确的比对结果,占测序EST的76.6%。测序的ESTs片段中最短的为136 bp,最长的691 bp,平均长度为456 bp,有41条序列带有Poly(A)尾。功能已知基因的EST涉及大豆的细胞自身保护、信号传导、抑制病原菌生长、系统获得性抗性以及持家基因等许多方面,其中SAR（Systemic aquired resistance）系统基因在表达谱中的种类和数量最多。未知功能ESTs与GenBank的dbEST库中序列比较表明,其中许多与生物、非生物胁迫cDNA文库来源的ESTs同源。 相似文献
14.
干旱胁迫下斑茅消减文库的构建及分析 总被引：6，自引：0，他引：6
以干旱胁迫下斑茅(Saccharum arundinaceum Retz.)叶片组织的cDNA为Tester，正常生长条件下斑茅叶片组织cDNA为Driver，利用抑制性消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）构建斑茅干旱胁迫消减文库。文库克隆总量约为30 000个，克隆重组率为99.2%；随机从文库中挑取3500个克隆分析表明，插入片断长度主要集中在200~1 000 bp之间，500 bp以上的有463个克隆，500 bp以下的有3 037个克隆，平均长度约450 bp; 通过随机对16个文库阳性克隆的测序及分析，3个克隆与ATP-NAD kinase、Aldo/keto reductase和锌指蛋白高度同源，3个克隆没有同源性，10个与逆境相关，是功能未知的EST。选择编号为EL0149和EL0145两个克隆进行Northern杂交验证，结果表明EL0149克隆为干旱胁迫上调表达的EST序列，而EL0145在正常供水和干旱条件下均无明显的的杂交信号。说明本研究克隆的SSH文库质量较高，可以进一步利用SSH文库结合芯片表达谱分析解析作物水分胁迫下的相关抗旱基因网络。 相似文献
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甘蓝型油菜种子不同发育时期SSH文库的构建 总被引：5，自引：1，他引：4
利用抑制差减杂交技术构建了20 d和35 d甘蓝型油菜湘油15发育种子特异表达基因的SSH文库。随机挑取单菌落进行PCR表明,文库质量较好。在20 d和35 d SSH文库中随机挑选489个阳性克隆进行测序,获得452条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行Blast比对及功能注释,比较20 d和35 d SSH文库的基因表达谱,发现在20 d SSH库中参与糖代谢的基因出现频率较高,而在35 d SSH库中与脂肪酸储存有关的油体蛋白家族、与脂肪酸转运有关的柠檬酸合酶、与脂肪酸合成有关的酰基载体蛋白去饱和酶等,参与油脂代谢相关基因出现频率较高。该结果对进一步研究油菜脂肪酸代谢调控的分子机制打下了基础。 相似文献
17.
盐胁迫下陆地棉耐盐品种根系的抑制消减文库构建 总被引：7，自引：3，他引：4
采用抑制消减(SSH)杂交技术构建了陆地棉耐盐品种中棉所35在盐(0.4%NaCl)胁迫后1 d、3 d、5 d和7 d的混合SSH文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。随机挑选200个阳性克隆进行测序,获得160余条高质量的表达序列标签（EST）。对序列进行BLAST比对及功能注释,其中有62条unigene 未获得同源性匹配, 42条与未知功能的序列同源性较高;其余56条功能已知的unigene中,与抗逆直接相关的基因有14个,占8.8%,参与新陈代谢及信号转导的基因有11条和10条, 分别占6.9%和6.3%,参与转录调控的基因8条,占5.0%。最后,对这些基因在盐胁迫中的作用进行了注释与讨论。 相似文献
18.
应用抑制性差减杂交筛选副猪嗜血杆菌4型菌株可能毒力基因 总被引：1，自引：0，他引：1
为了寻找副猪嗜血杆菌可能毒力基因,采用抑制性差减杂交技术,以HPS有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)为研究对象,构建差减杂交文库,利用Southern Blot分析和PCR鉴定进行差异基因片段的筛选。从构建的文库中共筛选得到7个特异性差异基因片段,经同源性分析,其中5个片段分别与噬菌体重组蛋白、糖基转移酶/荚膜多糖磷酸转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、核糖体蛋白丙氨酸转移酶和ABC型硝酸盐/磺酸盐/碳酸氢盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性;2个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关。利用PCR对上述可能与毒力相关的差异基因片段在9种不同血清型HPS中的分布进行了检测,结果表明,7个片段存在于多数的有毒力菌株(血清4,5,12,14,15型)中,而在无毒力菌株(血清3,11型)中均未检测到。利用SSH技术成功构建了HPS有毒力菌株SW124和无毒力菌株H465的差异表达基因差减文库,筛选获得了7个差异基因片段,且上述片段在HPS不同血清型有毒力菌株中分布广泛。 相似文献
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]斜纹夜蛾取食诱导棉花抑制性消减文库的初步构建及生物信息学分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了筛选棉花抗逆基因,实验室构建了棉花被斜纹夜蛾幼虫取食诱导的正、反向抑制性消减文库。文库随机各挑取1000个克隆进行PCR鉴定,发现插入片段长度主要集中在200~1000 bp之间。经反向Northern杂交筛选,正向文库随机挑取250个克隆测序,得到了35条非重复序列ESTs,反向挑取150个克隆,得到24条ESTs。GenBank数据库BLAST序列相似性比对功能分析表明,斜纹夜蛾幼虫取食胁迫棉花的应答过程涉及信号传导、基因调控、抗胁迫、防御反应、能量合成代谢、细胞生长延伸等多个生物途径。诱导表达的基因对斜纹夜蛾取食胁迫功能表现为一定的直接或间接保护作用。 相似文献