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【研究目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的快速鉴定检测是控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。【方法】通过汁液摩擦接种、透射电镜观察、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)和RT-PCR方法对该病毒进行鉴定;同时对RT-PCR反应体系及扩增程序进行优化,建立CGMMV免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)检测方法。【结果】血清学、生物学、电镜观察和分子生物学方法证明供试样本为黄瓜绿斑驳花叶病毒引致。IC-RT-PCR方法可以简化RNA的提取,降低对试验材料要求。【结论】IC-RT-PCR的建立为CGMMV的检测提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测方法。 相似文献
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黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是瓜类作物上重要的病原病,需建立快捷、准确的检测方法.以硝酸纤维素膜为固相载体,采用ELISA双抗夹心法建立了对CGMMV的可视化蛋白芯片检测方法,并对捕获抗体稀释倍数、样品孵育时间、酶标抗体孵育时间、显色温度等进行优化.结果表明,最佳检测条件为:捕获抗体稀释倍数1∶5,样品20℃孵育1h,酶标抗体20℃孵育1h,20℃15min显色.以50批葫芦科种子为样品,对可视化蛋白芯片检测与DAS-ELISA检测进行了比较,其检测结果吻合率达98.0%;经PCR检验,检测结果一致性良好.说明该方法能对植物病毒做出快速、准确的检测. 相似文献
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根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测. 相似文献
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黄瓜绿斑驳花叶病毒生物学特性及对西瓜生长的影响 总被引：7，自引：0，他引：7
对黄瓜绿斑驳花叶病毒(coculnber green mottle mosaic virus,CGMMV)在辽宁省的分布、生物学特性及病毒侵染对西瓜产量和品质的影响进行了研究.结果表明:CGMMV在辽宁省的营口、鞍山、沈阳、丹东、大连、辽阳等地均有分布;在供试的5科21种植物中,病毒仅可侵染葫芦科的西瓜、黄瓜、葫芦、南瓜、角瓜、甜瓜、瓠瓜7种植物,并表现系统花叶症状.该病毒致死温度95～100℃,稀释限点104～10-5,体外保毒期119d.电镜观察病毒粒子直棒状,长300nm,宽15nm.RT-PCR检测表明,盖州、台安、新民的西瓜花叶样品为黄瓜绿斑驳花叶病毒两瓜株系.利用春秋两季大棚栽培西瓜接种试验表明,西瓜感染CGMMV后,导致植株生长缓慢,结瓜稍小,自根西瓜产量减产幅度很大,秋季大棚减产38.7%～47.6%,春季大棚减产11.4%～19.4%;采用葫芦嫁接的两瓜产量损失变化较小,秋季大棚减产3.4%～17.5%,春季大棚减产2.5%～9.1%.另外,研究结果表明,CGMMV侵染直接导致西瓜倒瓤,使西瓜丧失食用价值,血清学检测倒瓤西瓜携带CGMMV. 相似文献
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针对目前黄瓜各种真菌性病害、细菌性病害和病毒性病害高发的现状,对天津地区黄瓜病害的发生情况进行田间观察,并运用试纸条法、PCR法及RT-PCR法对黄瓜种子和叶片样品进行检测。结果表明:田间观察发现,天津地区黄瓜病害主要有细菌性病害、真菌性病害及病毒性病害,其中真菌性病害最为普遍,褐斑病、白粉病、霜霉病多发;试纸条法在30份黄瓜品种种子样品中检出种传病害瓜类细菌性果斑病病原(Aac)1份,在11份叶片样品中检测出黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和烟草花叶病毒(TMV)各1份;PCR法在30份种子样品和2份疑似病害叶片样品中有3份种子样品检出细菌性角斑病;RT-PCR法在30份种子样品和6份疑似病害叶片样品中有1份叶片同时检出黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和烟草花叶病毒(TMV)。 相似文献
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侵染丝瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒山东分离物分子鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
2013年,在山东泰安采集到疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的丝瓜样品,利用该病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)特异引物CG-CPF/CPR对样品进行扩增并测序。所得序列(GenBank登录号:KJ187042)经NCBI BLAST比对,与已登录的CGMMV序列的相似性均大于92.6%,确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。系统进化分析表明,CGMMV山东丝瓜分离物(CGMMV-SDLoofah)与辽宁分离物(CGMMV-LN)等大多数国内CGMMV分离物同聚为一个进化组,从而进一步确定了CGMMV山东丝瓜病毒分离物为黄瓜绿斑驳花叶病毒。这是首次报道黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染丝瓜。 相似文献
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江苏省葫芦科作物6种病毒的多重RT-PCR方法及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
《江苏农业学报》2015,(4)
江苏省葫芦科作物上的病毒主要有小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、西瓜花叶病毒(WMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)、烟草花叶病毒(TMV)和番木瓜环斑病毒(PRSV),通常发生复合侵染。基于Gen Bank中这6种病毒的核苷酸序列保守区设计特异性引物,在单重RT-PCR技术的基础上,通过对影响2种多重RT-PCR扩增的DNA聚合酶浓度、d NTPs及镁离子浓度、退火温度、延伸时间、循环次数等因素进行优化,对检测灵敏度进行测定,建立了2种PCR反应同时检测葫芦科作物上6种病毒的多重RT-PCR方法。结果显示:2种多重RT-PCR体系均能同时扩增出各自特异性片段,测序分析结果表明序列同源性在97%以上;优化的2种多重RTPC体系检测灵敏度为总RNA稀释102~103倍,应用于江苏省210份样品的检测结果与单重RT-PCR一致,体现了检测的可靠性;检测结果表明近年来江苏省葫芦科作物以种子传播的ZYMV和CGMMV侵染为主,病毒的复合侵染率达75.24%。 相似文献
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黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科作物上重要的病毒之一.用提纯的黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫新西兰大白兔制备CGMMV的多克隆抗体.该多克隆抗体的间接ELISA效价达1∶512 000,与CGMMV17.5 ku外壳蛋白有特异性反应,而与烟草花叶病毒、齿兰环斑病毒和健康植物没有任何反应.用ACP-ELISA分析多抗灵敏度表明多抗检测1∶40 960倍稀释的CGMMV病叶时仍呈阳性反应.用该多抗建立了检测CGMMV的免疫斑点法(dot-ELISA)和免疫捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR).病叶汁液可被dot-ELISA检出的最大稀释度为1∶10 240.IC-RT-PCR从感染CGMMV的病叶组织中扩增到与预期大小相同的480 bp DNA条带,且当CGMMV病叶稀释1∶163 840倍时检测仍呈阳性.检测CGMMV的dot-ELISA和IC-RT-PCR方法的建立为该病毒病的诊断和控制提供了技术支撑. 相似文献
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为了揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)安徽分离物分子变异及系统进化情况,从安徽省5个地区采集感染CGMMV的葫芦科样本。提取感病样本总RNA,经RT-PCR扩增、克隆和测序,获得17个CGMMV分离物的cp基因序列。序列比对发现,17个CGMMV安徽分离物的cp基因核苷酸序列相似性极高,达98.4%~100%,与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物cp基因核苷酸序列相似性也非常高,达98.6%~100%,而与CGMMV西班牙分离物和俄罗斯分离物cp基因核苷酸序列相似性相对较低,为90.7%~92.6%。从构建的系统关系树可以看出,17个CGMMV安徽分离物与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物形成1个单独的分支,而CGMMV俄罗斯与西班牙分离物聚成另1个分支,说明来源于中国和东亚的CGMMV亲缘关系较近。 相似文献
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利用DAS-ELISA和RT-PCR等检测方法,对北京市延庆地区疑似感染病毒的百合植株进行了检测,并将RT-PCR扩增到的产物进行克隆及序列分析验证。DAS-ELISA结果表明：百合叶片的粗汁液与TuBV的抗体呈现阳性,初步确定北京市延庆地区百合感染郁金香杂色病毒（TuBV）。RT-PCR检测结合克隆测序结果表明：郁金香碎色病毒CP基因的核苷酸序列与GenBank上已登录的（AB090385.1,AB078007.1和S44147.1）郁金香碎色病毒的核苷酸序列的同源性均为100%,与已登录的（qb｜AAB19407.1｜,dbj｜BAD02938.1｜和dbj｜BAB83899.1｜）氨基酸序列同源性均在95%以上,同源性较高,进一步证明北京市延庆地区百合感染有郁金香杂色病毒（TuBV）。 相似文献
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【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus,BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）,建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设计2对特异性引物,以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料,提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测,测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA,将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释,依次稀释为原液的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍作为模板,分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增,测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后,连接于pMD18-T载体,进行克隆测序和序列比对,进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测,同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管,将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合,建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示,最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L-1、SMV 0.4 μmol·L-1,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为35。特异性测定结果表明,多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 bp特异性目的条带,从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 bp特异性目的条带,从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 bp特异性目的条带,而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果表明,当dsRNA原液稀释至10-3倍时,无论是多重RT-PCR,还是单一RT-PCR均未扩增出特异性目的条带,多重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏度相当,为10-2倍dsRNA原液。多重RT-PCR扩增产物克隆测序和序列比对结果显示,BPMV、SMV所测的序列全长分别为542和221 bp,与预期大小完全相符,且与已报道的各病毒基因序列高度同源,证实了多重RT-PCR结果的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法分别对来自于4个国家的大豆种子样品进行检测,结果从3份美国大豆种子样品检出BPMV,1份美国大豆种子检出SMV,1份阿根廷大豆种子检出SMV,2份中国大豆种子检出SMV,该结果与单一RT-PCR验证结果一致,阳性符合率达100% 。建立的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子中成功扩增出2条特异性目的条带,而从健康大豆种子中未扩增出特异性目的条带。【结论】建立的多重RT-PCR检测方法为进境大豆种子上BPMV、SMV的快速检测提供了参考。 相似文献
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百合无症病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测 总被引：25，自引：0，他引：25
应用DAS-ELISA,RT-PCR和IC-RT-PCR技术检测百合无症病毒（LSV）。 结果表明:RT-PCR和IC-RT-PCR分别可从2 ng和200 ng百合叶片组织中检测出LSV,分别是DAS-ELISA敏感度的1 000倍和10倍。百合鳞茎的不同取样部位对PCR检测结果的影响较大,RT-PCR难以从鳞片和根部检测出病毒,但IC-RT-PCR可以检测出病毒。 相似文献
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胶体金免疫层析试纸结合RT-PCR法快速检测烟草环斑病毒 总被引：1，自引：0，他引：1
利用烟草环斑病毒胶体金免疫层析检测试纸条,对烟草环斑病毒3个分离物进行了快速检测。结果表明,试纸条在10min内,可特异性检出烟草环斑病毒的3个分离物,对番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄黑环病毒和健康叶片无反应。剪下试纸条上显示的检测带,进行RT—PCR,能扩增到与预期大小相同的DNA条带。试纸条检测烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg·mL^-1,试纸条检测烟草环斑病毒的病汁液,检测灵敏度在10^-3（W／V）,试纸条检测灵敏度与DAS—ELISA方法灵敏度基本相同。 相似文献
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【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVYN及PVYO样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。 相似文献