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1.
[目的]对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gE基因表位进行原核表达,并对表达产物进行免疫原性鉴定。[方法]利用PCR扩增出gE基因2段表位(gE-A、gE-B),并构建原核表达重组质粒pET-32a-gE。将其转化BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达。表达的gE重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Westernblot分析。[结果]重组表达质粒pET-32a-gE经过PCR、双酶切及测序证明成功构建重组质粒。SDS-PAGE结果表明,gE蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约52ku,与预期蛋白分子量一致。纯化后的gE重组蛋白浓度为0.254mg/mL。免疫印迹结果表明,纯化后的gE重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好。[结论]成功表达了gE基因表位蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,可作为检测IBRV的gE抗体的候选抗原。 相似文献
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【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。 相似文献
3.
[目的]对牛传染性鼻气管炎病-毒(IBRV) gD基因表位进行原核表达,并对表达产物进行纯化鉴定.[方法]利用PCR扩增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C,并构建原核表达重组质粒pET-28a-gD.将其转入BI21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达.表达的gD重组蛋白经亲和层析纯化后,进行Western blot分析.[结果]重组表达质粒pET-28a-gD经PCR、双酶切及测序证明构建正确.SDS-PAGE表明,gD蛋白在大肠埃希菌中高效表达,表达的重组蛋白相对分子量约48 ku,与预期的蛋白分子量一致.纯化后的gD重组蛋白浓度为0.128mg//ml,免疫印迹结果显示纯化后的gD重组蛋白能与IBR标准阳性血清发生特异性反应,说明其免疫原性良好.[结论]成功表达了gD基因表位蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防IBR基因工程亚单位疫苗的候选抗原. 相似文献
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兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究兔出血症病毒（RHDV）VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b（＋）为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。 相似文献
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[目的]表达出猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap),为PCV3免疫学检测方法建立基础.[方法]用PCR技术扩增PCV3-Cap基因片段,与pET-32a原核表达载体定向连接,构建重组原核表达质粒.经大肠杆菌表达后,通过SDS-PAGE来检测目的蛋白的大小与存在方式,并用小鼠抗PCV3-Cap抗体进行Western blot检测.[结果]用pET-32a原核表达系统成功表达出重组PCV3-Cap融合蛋白,其多以包涵体形式存在,纯化后的融合蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清发生特异性结合,显示出良好的免疫反应性.[结论]原核表达出具有良好免疫反应性的PCV3 Cap. 相似文献
6.
[目的]研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位（NDV F2-3）的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。 相似文献
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为了原核表达兔源抗凋亡蛋白Bcl-2,并诱导表达纯化该蛋白后制备多抗,采用RT-PCR扩增Bcl-2编码序列,并将该序列克隆至pET-32a(+)载体,获得重组pET-32a-Bcl-2质粒转化BL21(DE3),筛选最佳表达条件,通过亲和层析纯化目的蛋白质,最后经Western blot鉴定后免疫小鼠。结果显示,成功扩增Bcl-2编码序列并构建了pET-32a-Bcl-2表达载体;SDS-PAGE结果显示,在16℃,5 h,0.5 mmol/L IPTG的表达条件下,重组蛋白Bcl-2能够高效可溶性表达;Western blot结果表明纯化后的表达产物为高纯度的Bcl-2重组蛋白,将该蛋白质免疫小鼠后获得了特异性抗体,该抗体能够特异性识别重组Bcl-2蛋白,并应用该抗体鉴定RK13-B细胞中Bcl-2蛋白的过表达。 相似文献
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猪瘟病毒E2糖蛋白主要抗原域的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验利用PCR方法从pUC18-E2上扩增出E2基因的主要抗原域片段,长为601 bp,将该PCR产物克隆到原核表达载体pET32a上,得到pET32a-e2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,目的蛋白以包涵体形式表达,其分子量42KD左右;Ni亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blot检测.pET32a-e2重组子的构建及蛋白表达与纯化为进一步制备多克隆抗体或单克隆抗体打下了基础. 相似文献
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[目的]构建青天葵器官大小调控基因——Erb3结合蛋白(Erb3-binding protein,EBP1)编码基因的原核表达载体,以期为通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定基础。[方法]将引入酶切位点的NfEBP1基因的PCR产物及表达载体pET-28、pET-16b分别进行双酶切,之后连接相应的酶切产物,热击转化到E.coli Top10细胞,通过菌落PCR、测序和酶切筛选阳性重组子。将确认的阳性重组子质粒转化至E.coli BL21表达宿主菌,并对其进行双酶切验证。[结果]构建了重组表达质粒pET-28-NfEBP1-1188和pET-16-NfEBP1-1188,其转化E.coli BL21表达宿主细胞后,分别获得含有2个载体的工程菌。[结论]该研究成功构建了青天葵EBP1基因的原核表达载体,为后续通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定了基础。 相似文献
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[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。 相似文献
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OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。 相似文献
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[目的]为了研究PCV2-ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化。[方法]用PCR方法扩增PCV2 ORF2基因3′端片段,PCR产物经酶切后与经同样处理过的pET32a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化BL21感受态细胞;重组菌液用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。[结果]ORF2基因在大肠杆菌中正确表达,表达的融合蛋白的分子量约为33 ku;在37℃、1 mmol/L浓度下,诱导时间为6 h时表达量最大,占细菌总蛋白的23.62%。表达产物主要以包涵体的形式存在,将包涵体溶解后过Ni-NTA柱纯化可得到较为纯净的目的蛋白。[结论]该研究为猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎和肾病综合征(PDNS)等疾病的防治奠定了基础。 相似文献
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[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。 相似文献
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金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达(英文) 总被引：1，自引：0，他引：1
[Objective] The study aimed to clone the FnBP ligand binding gene of Staphylococcus aureus and run prokaryotic expression by constructing a prokaryotic expression vector. [Method] The gene encoding FnBP ligand binding gene was amplified from S.aureus chromosomal DNA by PCR technique. After T-A cloning, plasmid pMD18- FnBP was constructed. pMD18- FnBP and pET28a(+)were digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ double enzymes, then the purified FnBP ligand binding gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-FnBP was thus constructed. The constructed plasmid pET28a-FnBP was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. The bacterium was induced by IPTG and the expressed products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. [Result] The gene fragment with the length of 370 bp was amplified by PCR approach. One approximately 30 kD exogenous protein was observed in SDS-PAGE analysis. Western blot analysis indicates the protein has antigenicity of S.aureus. [Conclusion] The FnBP ligand binding gene of S.aureus was successfully cloned and expressed in prokaryotic cells. 相似文献
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重组蛋白sHLA-G1的原核表达与纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
为了进一步在蛋白质水平对人白细胞抗原HLA-G进行分析,利用已经构建好的克隆质粒pGEM-T-HLA-G1,进一步构建了重组原核表达质粒pET28a-sHLA-G1。SDS-PAGE检测表明,重组蛋白sHLA-G1在大肠杆菌(E.coli)中得到稳定表达,原核表达的重组蛋白sHLA-G1主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经充分洗涤、尿素溶解后用钴离子树脂纯化,并用SDS-PAGE和Western印迹进行了分析,鉴定结果表明,该蛋白纯度达到90%以上,并能与HLA-G特异性抗体87G反应。该研究结果为进一步的复性工作奠定了基础。 相似文献
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[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。 相似文献
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[目的]克隆和表达副猪嗜血杆菌菌毛蛋白pilA基因。[方法]对已发表的HPS的pilA序列进行分析,合成引物,并以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS的pilA编码基因,获得目的基因片段;构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达至大肠杆菌BI21（DE3）中,进行SDS-PAGE与Western blot检测。[结果]表达的重组蛋白分子质量与预期的43 kD一致。[结论]该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础。 相似文献
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[目的]克服传统方法制备黏附素抗原的缺点。[方法]应用PCR对猪源性产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的黏附素F4、F5和F6的质粒中扩增出faeG、fanC和fasG基因片段,克隆测序并与pET 32a(+)构建重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli表达菌株BL21(DE3),并分析其免疫原性。[结果]重组表达载体经IPTG诱导获得高效表达。血凝抑制试验表明,鼠抗血清能抑制标准的ETEC强毒株凝集红细胞,抑制效价在1∶128以上。这说明克隆表达的猪源ETEC黏附素蛋白具有良好的免疫原性。[结论]该研究可为进一步开发抗体制剂奠定基础。 相似文献