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为了探究火龙果溃疡病病原菌的致病机理,笔者利用农杆菌介导的遗传转化技术,分析了根癌农杆菌浓度、分生孢子萌发时间以及共培养温度等3个主要因素对遗传转化效率的影响,建立火龙果溃疡病菌的遗传转化技术体系,并对转化子进行筛选。结果表明,当农杆菌浓度OD600=0.5、分生孢子萌发时间24 h、共培养温度25 ℃时遗传转化效率最高（833个转化子/106分生孢子）;随机挑选200个转化子进行筛选,获得3株菌落形态与野生型菌株差异较大的转化子,4株产孢量减少的转化子,5株产孢量增加的转化子,6株致病力下降的转化子。 相似文献
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《西南农业学报》2020,(8)
【目的】建立农杆菌介导荸荠秆枯病菌(Cylindrosporium eleocharidis)的遗传转化体系,构建该病菌的突变体库并进行突变体筛选,为荸荠秆枯病病原菌的分子机理研究提供参考依据。【方法】运用农杆菌介导的真菌转化方法,将含有绿色荧光蛋白(GFP)的双元载体pEX4转化至荸荠秆枯病菌野生型菌株Ceh中,利用PCR、Southern blotting杂交和荧光显微镜检测等技术验证转化子。通过单因子变量[共培养基中的乙酰丁香酮(AS)、农杆菌诱导时间、病原菌孢子浓度、IM诱导培养基pH、共培养时间和共培养介质]试验,优化农杆菌遗传转化体系,并建立该病菌突变体库,分析突变体的形态变异和致病性。【结果】获得的最佳遗传转化条件为:共培养基中AS浓度为300μmol/L,农杆菌诱导时间6 h,真菌孢子浓度为10~7个/mL,诱导培养基pH 5.6,共培养时间72 h,共培养介质为硝酸纤维素膜。在该优化条件下,农杆菌遗传转化体系转化效率达600～700个转化子/10~7个孢子。随机挑取转化子进行PCR检测均为阳性,T-DNA单拷贝插入率达77.8%,荧光显微镜均可检测到荧光信号。【结论】成功构建了农杆菌介导的荸荠秆枯病病原菌遗传转化体系和T-DNA插入突变体库,并筛选获得表型和致病性缺陷突变体,可用于指导荸荠秆枯病菌基因功能和病菌与寄主互作研究。 相似文献
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[目的]通过农杆菌介导的遗传转化(ATMT)方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究.[方法]通过单因子变量(试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度)试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体.[结果]得到的最佳转化条件为:农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜.通过条件优化,转化效率可达到800~900个转化子/106个孢子.[结论]通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础. 相似文献
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【目的】通过农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量（试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度）试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为：农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25 ℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化,转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。 相似文献
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以枣黑斑病菌和含有双元载体根癌农杆菌为材料,对分生孢子悬浮液的浓度、农杆菌液浓度、菌株共培养时间、共培养温度等条件进行优化,筛选出枣黑斑病菌遗传转化的最佳体系。以农杆菌介导枣黑斑病菌最佳的遗传转化体系为基础,进行GFP标记实验室保存枣黑斑病菌的菌落,继代培养后,通过观察菌落生长形态,生长速度以及致病力测定筛选获得遗传相对稳定、与野生枣黑斑病菌相比性状没有发生明显变化的荧光蛋白标记菌株。挑取单菌落于10 ml的LB液体培养基(含100μg·ml~(-1)卡那霉素)中,28℃震荡(180 r/min)培养48 h,吸取400μl培养液于20 ml含有200μmol·L-1的AS(乙酰丁香酮,acetosyringone)、100μg·ml~(-1)卡那霉素的AIM液体培养基中,28℃震荡(180 r/min)培养5~6 h共培养。将Alternaria alternata菌株所产的孢子洗下,制成浓度为1.0×106个/ml的悬浮液。分别取上述农杆菌液与孢子悬浮液各100μl均匀混合,涂布于含有200μmol·L-1AS和100μg·ml~(-1)卡那霉素的AIM平板上的硝酸纤维化膜(NC膜)表面,在25℃下黑暗共培养60 h,然后将NC膜转到含有潮霉素B的PDA平板上4~7天,获得约200个转化子,获得GFP标记的菌株。 相似文献
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为建立低成本、快速、高效的根癌农杆菌介导的致病疫霉转化体系,以菌株 HK0919为材料,从抗生素筛选浓度、共培养转膜方式、乙酰丁香酮（AS）浓度、共培养时间和共培养温度等方面对致病疫霉的转化体系进行了研究。综合各因素优化结果,建立的转化体系条件为：以1．0μg/mL的潮霉素B进行转化子筛选,采用玻璃纸作为共培养介质,AS浓度为200μmol/L,培养6 d,温度为22℃。在此条件下的转化效率为每106个游动孢子获得50～60个转化子。随机选取10个转化子,利用特异性引物对潮霉素抗性基因hph进行PCR扩增,转化子均能扩增出800 bp左右的预期条带;同时,利用根癌农杆菌vir基因特异引物对转化子进行 PCR扩增,排除了转化子被农杆菌污染所致的假阳性;转化子继代培养5代后,仍能在含潮霉素 B的黑麦培养基上生长。说明外源T DNA已成功整合到致病疫霉基因组中,并能稳定遗传。 相似文献
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[目的]为构建高效的康乃馨遗传转化体系奠定基础。[方法]以康乃馨叶片为受体材料,通过抗G418筛选,探讨预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度、共培养时间等因素对根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的影响。[结果]20 mg/ml G418是康乃馨叶片转化的适宜浓度。随着预培养时间的增加,康乃馨叶片的存活率降低,预培养2~3 d时抗性芽分化率较高。当根癌农杆菌OD600为0.5~0.8时,抗性芽分化率较高,适合康乃馨转化。共培养2~3 d时,康乃馨叶片生长状态好,抗性芽分化率最高。[结论]预培养、共培养各2~3 d,菌液浓度OD600为0.5~0.8是根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的适宜条件。 相似文献
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针对香蕉枯萎病病原菌的1号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp cubense race 1,Foc1),以潮霉素抗性为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的转化体系,确定影响转化效率主要因子是:YEB平板上单菌落培养时间为40 h、在LB液体摇床培养中培养时间28~30 h(200 r/min)、乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、共培养温度为25℃、IM固体培养基pH值为5.5。在此条件下,转化效率能达到150~200个转化子/106个Foc1孢子。在选择性培养基筛选转化子时,我们首次采用了直接覆盖选择性培养基方法,比传统的转膜反贴方法更方便简单。在荧光显微镜下观察到转化子的绿色荧光。潮霉素抗性测试发现转化子的抗性表现稳定。 相似文献
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【目的】链格孢菌（Alternaria alternate）苹果致病型是苹果上的重要致病菌,可以侵染苹果叶片和果实。论文旨在建立农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型高效稳定的分子转化体系,为在分子水平上研究链格孢苹果致病型病菌的致病机制提供技术支持。【方法】质粒pKO1-HPH是以pCAMBIA1300骨架为基础构建的穿梭质粒,含有潮霉素抗性基因,并在其多克隆位点上插入了绿色荧光蛋白基因,这个质粒在大肠杆菌和农杆菌细胞中都能够稳定地复制繁殖。将质粒pKO1-HPH采用冻融法转化到农杆菌菌株AGL1中,然后与链格孢苹果致病型菌株XP-1的分生孢子在诱导培养基上共培养进行基因转化,转化子在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选;在含有50 μg·mL-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上检测转化子细胞中抗性基因在转化子中的表达情况;用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白基因在转化子细胞中的表达情况。在初步确认可以将绿色荧光蛋白和潮霉素B磷酸转移酶基因转入链格孢苹果致病型菌株中后,对菌落培养时间、转化前分生孢子的预处理方法对转化效率的影响进一步优化。转化子的稳定性采用分生孢子5次继代培养后,能否在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上稳定生长来检测;采用PCR方法检测绿色荧光蛋白外源基因和潮霉素B磷酸转移酶基因是否存在于转化子基因组中;用Southern杂交检测外源基因在转化子基因组中插入的拷贝数;在苹果果实和叶片上接种检测转化子致病性的变化。【结果】将100 μL孢子悬浮液（含105孢子）涂布于马铃薯-胡萝卜-琼脂平板上菌落培养36-48 h后,链格孢苹果致病型菌株XP-1可以产生足量的孢子用于农杆菌介导的分子转化。将分生孢子用无菌水洗下,在4℃处理6 h,再与含质粒pKO1-HPH的农杆菌进行诱导共培养,转化子在含有50 μg·mL-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选,转化效率较好,107个分生孢子转化可获得约200个转化子。转化子经过5次继代培养,对潮霉素B的抗性没有改变。特异性引物PCR检测表明外源基因能够成功地整合到供试菌株的基因组中;Southern杂交表明外源基因多以单拷贝形式随机插入到链格孢苹果致病型菌株XP-1细胞的基因组中;转化子的菌丝和分生孢子在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光,说明荧光蛋白基因在菌丝及孢子中均能够成功表达。通过部分转化子的致病性试验,筛选获得数个在苹果果实和叶片上致病性都显著降低的菌株。【结论】建立了农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型稳定高效的分子转化体系,为进一步开展此病菌与其寄主的分子互作研究打下基础。 相似文献
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玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析 总被引：3，自引：2，他引：1
【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。 相似文献
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以尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)FO-11-06菌株为受体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(含pATMT1)介导的西瓜枯萎病菌的转化,并研究了转化介质和pH值对转化效率的影响。结果表明:在25℃下,采用乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600=0.15、尖孢镰刀菌分生孢子含量为1×106个/mL、pH值为5.1～5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH值为5.3时,转化效率最高,达到每106个分生孢子产生553个转化子。不同共转化介质对转化效率影响明显,玻璃纸和硝酸纤维素滤膜转化效率较高,每106个分生孢子获得551个和549个转化子,显著高于滤纸。通过转化,获得尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子1 989个,对生长速度、菌落颜色和产孢量等性状进行分析,发现有46个性状特异的突变体。研究结果为进一步研究尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长发育、致病机制和相关基因的功能奠定了基础。 相似文献
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影响农杆菌介导草菇遗传转化的因素研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以草菇Volvariella volvacea菌株V51为受体材料,用农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法转入抗冷冻蛋白基因(afp),探索不同的转化受体、农杆菌种类、乙酰丁香酮(AS)的浓度、共培养的温度、时间等因素对转化效率的影响,并采用PCR及Southern杂交检测afp基因是否整合到草菇的基因组中.结果表明:以D660 nm为0.15的EHA105为侵染的农杆菌菌株,加入200μmol/L AS进行预培养,侵染菌丝球后转入含有AS为200μmol/L的IMA培养基上,28℃,共培养60 h为最佳转化条件.PCR与Southern杂交结果证明afp基因已整合到草菇的基因组中. 相似文献
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【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。 相似文献
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玉米大斑病菌分生孢子形成的影响因素及GATA转录因子家族的表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】玉米大斑病(northern leaf blight of corn)是由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的一种威胁玉米生产的重要叶部病害。本研究旨在确定影响玉米大斑病菌分生孢子产量的主要因素;明确GATA家族成员基因在分生孢子形成时期的表达特征,为深入解析调控病菌发育及致病的分子机制打下基础。【方法】以玉米大斑病菌野生型菌株01-23为试材,探索13种不同培养基(乳糖酪蛋白琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆葡萄糖琼脂培养基、玉米茎秆琼脂培养基、玉米叶片葡萄糖琼脂培养基、玉米叶片琼脂培养基、玉米籽粒葡萄糖琼脂培养基、玉米籽粒琼脂培养基、玉米粉葡萄糖琼脂培养基、玉米粉琼脂培养基、查氏培养基、基本培养基、水琼脂培养基)、5种碳源(乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖)、以乳糖酪蛋白琼脂培养基为基础培养基,以5 g·L~(-1)的量分别添加不同的氮源(牛肉膏、蛋白胨、NH_4Cl、KNO_3、(NH_4)_2SO_4、NH_4NO_3)、pH(4、5、6、7、8、9)、温度(15、20、25、30、35℃)及光照强度(1 500、3 000、6 000、9 000 lx)等条件对分生孢子产量的影响;进一步利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析病菌菌丝形成时期和分生孢子形成时期GATA家族5个成员基因的表达量。【结果】利用单因素分析法确定了影响玉米大斑病菌分生孢子产量的主要因素,发现产孢量最大的培养条件为玉米叶片葡萄糖琼脂培养基,碳源为乳糖,培养温度为25℃,pH 8,光照条件为光暗交替各12 h,光照强度为6 000 lx。另外,还发现在培养基中添加KNO_3可显著提高分生孢子产量。对GATA家族5个基因的相对表达水平分析表明,与菌丝时期相比,在分生孢子形成时期GATA2的表达量明显上调,其他基因(GATA1、GATA3、GATA4、GATA5)表达量均显著下调。【结论】利用单因素分析法确定了影响玉米大斑病菌分生孢子产量的最佳培养条件;根据GATA家族5个基因相对表达分析结果,推测GATA2可能参与了玉米大斑病菌的分生孢子形成。 相似文献
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Effects of MEK-Specific Inhibitor U0126 on the Conidial Germination, Appressorium Production, and Pathogenicity of Setosphaeria turcica 总被引：1，自引：0，他引：1
Systemic studies on the effects of mitogen-activated protein kinase （MAPK） signal transduction pathway on the growth and development of Setosphaeria turcica is helpful not only in understanding the molecular mechanism of pathogenhost interaction but also in the effective control of the diseases caused by S. turcica. U0126, the specific MEK inhibitor, is used to treat S. turcica before the observation of the conidial germination, appressorium production, and pathogenicity of the pathogen. There is no significant effect of U0126 on the colony morphology and mycelium growth of the pathogen. After treatment with U0126, the growth of mycelium and conidia are normal, but the conidial germination, appressorium production, and pathogenicity of S. turcica on susceptible corn leaves are significantly inhibited. Under the definite concentration scope, an increase in U0126 concentration increases the inhibition degree of conidial germination and appressorium production, but the inhibition degree decreases with elongation of treatment time. The conidial germination, appressorium production, and pathogenicity of S. turcica on susceptible corn leaves are regulated by the MAPK pathway inhibited by U0126. 相似文献
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植物的耐盐性是一个多基因控制的复杂性状,将多个耐盐相关基因导入同一植物更有助于提高植物的耐盐能力.以玉米自交系H99、丹988的胚性愈伤组织为受体材料,通过愈伤组织对NaCl的敏感性试验,确定转化愈伤组织的适宜选择压,适宜愈伤组织转化的盐浓度为225 mmol/L.并对农杆菌遗传转化系统的条件进行了初步研究,用带有pCAMBIA-1301-CMO-BADH质粒的根癌农杆菌转化玉米愈伤组织,结果表明:采用EHA105的菌株振荡20h后,菌液OD值为0.5～0.6时侵染25 min为农杆菌转化的适宜条件.对移栽成活的36棵抗盐植株经PCR检测有2株呈阳性,阳性株率最高达到5.6％,初步证明目的基因已整合到玉米基因组中. 相似文献