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影响根癌农杆菌介导的丰香草莓遗传转化因素分析 总被引：4，自引：4，他引：0
将构建的携带NPTⅡ和AP-D基因的植物表达载体pBI121导入根癌农杆菌EH105中后,用其对草莓主栽品种丰香叶盘进行遗传转化,探讨了卡那霉素(Kan)的浓度、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间和筛选方式等因素对转化率的影响。结果表明:丰香草莓适宜的转化条件是Kan筛选浓度为20 mg/L,预培养时间为2~3 d,菌液浓度OD6000.3~0.5,侵染时间10~20 min;共培养2~3 d后将外植体接到含有5 mg/L Kan和500 mg/L Carb的诱导培养基上进行培养,以后每次继代逐步提高Kan选择压力至终浓度20 mg/L(每次增加5 mg/L);或共培养2~3 d后将外植体接到含有500 mg/L Carb的诱导培养基上,培养2周后继代到含20 mg/L Kan和400 mg/L Carb的培养基上进行选择培养。根据PCR检测结果,抗性愈伤组织转化率高达18.5%。抗性愈伤组织经进一步诱导,最后获得了17株抗性植株。本文探讨了影响丰香草莓转化的多个因素,以期建立高效的遗传转化体系,为草莓属植物种质的遗传转化奠定基础。 相似文献
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正交设计在杨树最佳遗传转化体系的建立 总被引：5，自引：2，他引：3
本试验以建立的南林95杨高频再生体系为基础,利用正交试验设计,通过GUS组织染色分析法研究了预培养时间、菌液浓度、AS浓度、侵染时间和共培养时间5个因素在4个水平上对南林95杨遗传转化的影响,并探讨了南林95杨转化中添加卡那霉素(Kanamycin)的适宜浓度。结果表明:外植体预培养7d,在含乙酰丁香酮AS200μmol/L、菌液浓度OD值为0.6的农杆菌液中侵染20min,共培养3d为最佳遗传转化体系,适宜的卡那霉素筛选浓度为50mg/L;经GUS染色检测和PCR分析表明,GUS基因已初步整合进南林95杨基因组中。 相似文献
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农杆菌介导高羊茅遗传转化体系的建立 总被引：3，自引：5，他引：3
为建立农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)遗传转化体系,以草坪型高羊茅品种凌志的胚性愈伤组织为受体材料,通过gus基因瞬时表达检测,研究了多种因素对农杆菌介导转化的影响。结果表明,农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织转化的适宜条件为:愈伤组织在含BAP和NAA各0.5mg/L的培养基上预培养3d;菌液浓度OD600值0.7,感染时间15min;农杆菌预培养基和悬浮培养基以及共培养基中添加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养温度23℃,共培养时间3d,共培养基pH值5.2。不同浓度潮霉素筛选效果试验表明,采用低浓度(50mg/L)潮霉素连续筛选,再生获得的转基因植株数最多,因此是最为可取的筛选方式。 相似文献
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黄淮麦区推广品种小偃22农杆菌遗传转化体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
小偃22小麦是目前陕西省生产上的主栽品种,在黄淮麦区其他地区也大面积推广种植。本文通过对小偃22小麦胚性愈伤组织的来源﹑生理状态和干燥时间,根癌农杆菌的接种浓度和侵染方式,AS的添加浓度,胚性愈伤组织和根癌农杆菌的共培养温度和共培养时间,潮霉素的筛选浓度和筛选方式等参数进行比较研究,建立了小偃22小麦农杆菌遗传转化体系。结果显示,以来源于幼穗的胚性愈伤组织作为转化受体较为适宜,愈伤组织生理状态为从幼穗直接诱导30d后继代1次并培养15d的胚性愈伤组织,农杆菌侵染前对胚性愈伤组织干燥处理30 min较为适宜;农杆菌菌液浓度为0.8OD,采用抽真空侵染5min＋非真空侵染10min的浸染方式,共培养温度为22℃,共培养时间为72h,AS的适宜添加浓度为150μmol/L;筛选方式选用在抗性愈伤组织筛选阶段经75mg/L潮霉素筛选后,在分化阶段不再进行筛选或采用25mg/L低浓度潮霉素筛选。通过重复转化验证试验和分子生物学鉴定,表明该遗传转化体系具有可行性。 相似文献
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为建立根癌农杆菌介导的草莓褪黑素基因高效遗传转化体系,以草莓品种“早红”叶片和叶柄为外植体,优化了影响根癌农杆菌遗传转化的因素,包括农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和预培养时间等,建立了适宜草莓“早红”的农杆菌遗传转化体系。结果表明,“早红”草莓适宜的转化条件是：外植体的最适预培养时间为2～3 d,农杆菌侵染的最佳菌液浓度为OD600 0.3～0.5,最适侵染时间为15 min,最适共培养时间为3 d。在此基础上,通过根癌农杆菌介导法将褪黑素合成关键酶N -乙酰转移酶（AANAT）和羟吲哚-氧甲基转移酶（HIOMT）基因AANAT和HIOMT转入草莓基因组,并对获得的抗性植株进行PCR和PCR-Southern blot检测分析,结果表明外源基因已经整合进草莓基因组中。RT-PCR分析证明外源基因已经在转录水平表达。 相似文献
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安祖花(Anthurium andraeanum)是近年来非常流行的年宵花卉之一。为了优化安祖花的遗传转化体系,本研究以安祖花Arizona品种组培苗的叶片为外植体,将构建好的重组质粒p SN1301-HYG-Ph CHS在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101介导下转化安祖花。优化后的体系为:首先将组培苗幼嫩叶片切块后置于1/3 MS预培养基(附加200 mg/L NH4NO3,0.5mg/L BA,0.05 mg/L 2,4-D,5g/L琼脂,30g/L蔗糖)中预培育3 d,然后用根癌农杆菌(菌液OD600=0.5)侵染10 min,将侵染过的叶片接种于MS培养基,28℃黑暗条件下共培养3 d,之后转移到附加有500 mg/L羧苄青霉素和30 mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基中进行筛选。结果表明,抗性愈伤组织形成率可达到5%~6%。对体系优化过程中获得的14株抗性转基因植株进行PCR检测,其中9株为阳性,证实矮牵牛查尔酮合成酶基因(Petunia hybrida chalcone synthase gene,PhCHS)已经转入安祖花Arizona中。该研究结果为利用转基因方法改良安祖花品种提供了技术保障。 相似文献
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EuFPS基因表达载体构建及对杜仲遗传转化的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pSH737和含有目的基因的pUC-FPS,定向连接得到重组质粒pSH-FPS,将其导入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导法对杜仲进行遗传转化,研究了卡那霉素(kanamycin,Km)浓度、预培养时间、菌液浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)浓度、共培养时间等对杜仲遗传转化效率的影响。结果表明,选择无菌苗苗龄15d的杜仲下胚轴,卡那霉素浓度50mg/L,农杆菌浓度OD600值0.3~0.6,侵染时间8min,侵染时菌体重悬液中添加50μmol/L乙酰丁香酮,共培养时间3d,抗性芽的获得率最高。对再生植株进行GUS检测发现有45%的植株呈阳性。 相似文献
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农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究 总被引：3，自引：1，他引：2
采用携带GUS基因双元表达载体p1301-Pubi-Ecppc的根癌农杆菌菌株C58c1、LBA4404和EHA105对4个春小麦品种的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明,3M1.5为最佳诱导培养基;扬麦158和扬麦10是用于小麦遗传转化的良好基因型。对农杆菌转化条件进行进一步优化,得出用农杆菌C58c1侵染预培养15d的扬麦158幼胚愈伤组织,当侵染液浓度为OD6000.8、侵染40min、共培养3d时,可以提高农杆菌介导小麦遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。对所得到的具有hyg抗性的愈伤和抗性植株进行GUS基因化学组织检测和PCR分子鉴定,初步证明Ecppc基因已整合到小麦再生植株基因组中。本研究初步建立了农杆菌介导小麦的遗传转化体系。 相似文献
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以爬行卫矛(Euonymus fortunei var. radicans)无菌苗下胚轴为外植体,在附加不同浓度植物生长调节的MS基础培养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明,0.5mg/L BAP和0.01mg/L NAA组合的诱导效果最佳,其不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2个。将含有雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)的植物表达载体pBCGm导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404, 通过农杆菌介导法遗传转化爬行卫矛的下胚轴,经PCR和PCR-Southern检测,GNA基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中,外植体不经预培养,菌液浓度OD=0.6,共培养3d,有利于获得最高遗传转化效率。 相似文献
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抗生素对高粱离体培养反应的影响 总被引：10，自引：1，他引：9
探讨了 5种抗生素对高粱离体培养反应的影响。在 3种抑菌抗生素中 ,羧苄青霉素和头孢霉素的抑菌效果较好。头孢霉素对高梁外植体离体培养的毒性比羧苄青霉素大 ,羧苄青霉素对愈伤组织的生长起促进作用 ,且只在高浓度才对分化有抑制作用。在农杆菌介导高梁遗传转化时 ,选用 2 5 0～ 5 0 0mg L的羧苄青霉素来抑菌是合适的。高梁不同基因型和外植体对潮霉素和卡那霉素的反应表现不同 ,但对潮霉素的反应比卡那霉素敏感。在筛选转化体时 ,以潮霉素较好 ,使用浓度对茎尖和幼胚以 2 5～ 5 0mg L为宜 ,对愈伤组织则以 5 0～ 75mg L为宜。 相似文献
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为建立高效的黑果枸杞组织培养与遗传转化体系,本研究以黑果枸杞叶片、茎节、茎段为外植体,在含有不同浓度组合的NAA和BAP培养基上进行愈伤组织和不定芽诱导比较;选择黑果枸杞叶片为材料,采用农杆菌介导法,将带有绿色荧光蛋白基因(sGFP)的双元表达载体导入黑果枸杞,探讨侵染时间和抗生素浓度对遗传转化效果的影响。结果表明,黑果枸杞的最适植株再生体系为:以叶片为外植体,MS基本培养基中添加0.5 mg·L-1NAA和0.3 mg·L-1BAP,愈伤组织诱导率为88.56%,不定芽诱导率为54.54%,将不定芽置于1/2MS培养基中进行生根诱导,生根率为95%;稳定高效的遗传转化体系为:农杆菌侵染液OD600为0.25,共培养3 d,卡那霉素(kanamycin)和羧苄西林(carbenicillin)浓度分别为25和250 mg·L-1。愈伤组织和不定芽诱导时经卡那霉素和荧光标记双重选拔,愈伤组织阳性率为85.47%,出芽生根后经PCR鉴定,阳性转化率为29%;利用实时荧光定量PCR检测转基因植株,导入的外源sGFP基因均有较高的表达水平。本研究为利用基因工程技术对黑果枸杞进行品种改良提供了技术支撑。 相似文献
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根癌农杆菌介导的山定子遗传转化的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以山定子叶片作为根癌农杆菌介导转化的受体,通过比较在卡那霉素筛选培养基上的抗性芽百分率,研究激素配比、乙酰丁香酮、脯氨酸、共培养时间、预培养时间、侵染时间对转化的影响。结果表明:预培养不利于山定子转化;菌液中添加乙酰丁香酮和脯氨酸对转化无明显影响;侵染10min,共培养3d抗性芽百分率最高;转化后叶片再生培养基的最佳激素配比为NAA1.0mg/L+BA2mg/L+TDZ4mg/L。抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到山定子基因组中。 相似文献
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K. Koivu J. P. T. Valkonen S. Suomaa R. Tavazza E. Pehu 《Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Plant Soil Science》2013,63(1):78-87
Abstract An Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation procedure was developed for the non tuber-bearing, diploid wild potato species Solanum brevidens, and the tetraploid S. tuberosum cv. Pito. Cointegrative transformation vectors pGV2260 and pGV3850, and binary vector pGUS-INT were employed in transformation of S. brevidens and Pito, respectively. Leaf and stem explants of S. brevidens and microtuber discs of Pito were precultured 24 h, and cocultivated 48 h on solidified callus induction medium with a 24-h liquid culture of A. tumefaciens C58C1 diluted 1:10 with liquid MS medium. Explants were rinsed with cefotaxime solution (500 mg/1) to remove Agrobacterium, grown without the selective agent kanamycin on solified callus induction media for 14 days, and then exposed to kanamycin selection for the first seven days on callus induction medium and subsequently on shoot regeneration medium. Shoots regenerated faster from stem explants than from leaf explants. Up to 49% and 57% of the transformed leaf explants of S. brevidens and microtuber discs of Pito, respectively, produced transformed shoots. 相似文献
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发根农杆菌介导转化小金海棠的影响因素 总被引：2，自引：1，他引：1
为了研究发根农杆菌介导的小金海棠的遗传转化体系,采用农杆菌侵染的方法,对影响Ri质粒诱导小金海棠产生发状根的各种因素进行了研究,结果发现,Ri质粒转化小金海棠形成发状根的效率,受发根农杆菌种类、浓度、生理状态及小金海棠外植体的种类、外植体在菌液中的侵染时间、共培养时间、基本培养基等多种因素的影响,加入20mg/L AS对转化效率影响不大。采用稀释5倍的处于对数生长期的8196菌株,感染小金海棠无菌苗幼嫩叶片5-10min,在MS培养基上共培养2d后转入含卡那霉素10mg/L、头孢霉素250mg/L的1/4MS诱导培养基上培养一个月,发根诱导效率最高可达93.3%.随机选择50条诱导的发根进行GUS染色,结果发现有96%发根GUS染色呈阳性。对48条GUS阳性的发根进行PCR检测,其阳性率为100%。高效的发根诱导体系为发根的进一步再生及转入外源基因奠定了基础。 相似文献
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为了优化根癌农杆菌介导的棉花下胚轴切段的基因转化体系,以苜蓿抗菌肽基因（alflafa antifungul peptide gene, alfAFP）为目标,利用GUS报告基因和潮霉素抗性基因的检测方法,分析和探讨了根癌农杆菌菌种、菌液浓度、浸染下胚轴的时间、共培养中乙酰丁香酮（AS）的浓度、共培养温度和时间等因子对基因转化的影响。优化分析表明,用农杆菌菌株LBA4404当OD600值为0.5-0.7的菌液浸染5-7日龄的棉花无菌苗下胚轴切段10-15分钟,在含200µmol/L AS的共培养基中21℃暗培养60h可更有效地提高转化率。经上述条件处理的下胚轴在含50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基上培养3周可产生转化率最高的愈伤。愈伤组织经分化培养获得15株再生棉花,经过PCR和southern-PCR分析,发现其中12株含有外源抗病基因alfAFP,可作为棉花抗病育种的种质。 相似文献
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摘要：将马铃薯(Solanum tuberosum )块茎特异蛋白patatin classⅠ基因cDNA与CaMV 35S启动子融合，构建了植物表达载体pBSSP。用电激法将表达载体导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后转化烟草(Nicotiana tabacum )叶片获得再生植株。经PCR、PCR-Southern、Northern杂交和蛋白质检测，证明patatin classⅠ基因cDNA已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。酯酰水解酶（lipid acylhydrolase, LAH）活性分析显示，转基因烟草植株的叶片中LAH活性明显提高。 相似文献