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旨在探究脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是否通过内吞途径以及通过何种内吞途径感染细胞,分别采用内吞途径抑制剂、网格蛋白抑制剂、巨胞饮途径抑制剂和肌动蛋白抑制剂作用于Hela细胞后接种EMCV,通过TCID_(50)、qRT-PCR和Western blot等方法检测病毒感染是否受影响。结果显示,内吞途径抑制剂和肌动蛋白抑制剂作用于Hela细胞后,TCID_(50)、qRT-PCR和Western blot等检测结果提示EMCV的感染受到抑制。表明EMCV可通过肌动蛋白参与的内吞途径感染Hela细胞。 相似文献
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为探讨超急排斥反应(hyperacute rejection,HAR)及延迟性异种排斥反应(delayed xenograft rejec-tion,DXR)分子调控机制,进行-α1,2岩藻糖苷转移酶基因(hHT)与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)融合表达载体pEGFP-C1-hHT的构建及在小鼠成纤维细胞表达的研究。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48 h后观察到GFP阳性细胞。同时对GFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot,检测hHT基因的整合及表达情况。PCR结果表明hHT基因整合入小鼠基因组,Western blot检测到hHT基因的表达。研究结果表明,成功克隆hHT基因并构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT,可应用于进一步转基因研究。 相似文献
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研究表达的丙型肝炎病毒(HCV)NS4B对Hep3B细胞非折叠蛋白质反应的影响。NS4B重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS4B通过脂质体转染Hep3B细胞,G418筛选和Western blot鉴定稳定转染细胞;RT-PCR检测稳定转染细胞内XBP1 mRNA剪接,Western blot鉴定ATF6蛋白切割,荧光素酶试验检测稳定转染细胞内GRP78和XBP1启动子活性。G418筛选和Western Blot鉴定证实获得稳定表达NS4B的Hep3B细胞;在该细胞内,XBP1 mRNA剪接、ATF6切割、XBP1和Grp78启动子激活均被检测到。NS4B在Hep3B的稳定表达诱导了非折叠蛋白质反应。 相似文献
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边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化的重组表达蛋白质为抗原,建立间接ELISA(r E2-ELISA)检测方法。通过反应条件优化,确定抗原包被浓度4.0μg/ml;封闭液为20 g/L BSA;血清最佳稀释度为1∶50,孵育1 h;二抗最佳稀释倍数为1∶30 000,作用45 min;以TMB为底物显色10 min。用该ELISA方法检测瘟病毒属的CSFV、BVDV阳性血清,结果均为阴性。对187份山羊血清样品进行临床检测,与Svanova试剂盒检测结果阳性符合率为76.25%,总符合率为74.87%;上述检测方法同时与Western blot鉴定结果进行比较,结果显示,Western blot结果与r E2-ELISA检测结果的符合率为79.55%,高于与Svanova试剂盒检测的符合率(72.73%)。表明建立的间接ELISA检测方法可适用于临床BDV血清样品的抗体检测。 相似文献
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【目的】制备大眼鰤鲈鱼真皮肿瘤病毒(WDSV)辅助基因orfA和orfC的多克隆抗体,并用其检测酵母和肿瘤细胞中目的蛋白的表达。【方法】以WDSV基因组序列为模板,PCR扩增WDSV orfA和orfC基因,分别构建其原核表达载体,转化Rosseta（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白后,采用皮下多点注射结合耳静脉加强免疫的方法免疫新西兰白兔,制备抗orfA和抗orfC的多克隆抗体,用Western blot法检测抗体的特异性。用制备的多克隆抗体检测orfA和orfC融合蛋白在酵母和HeLa299、SPC-A-1肿瘤细胞中的表达。【结果】PCR扩增获得了WDSV orfA和orfC基因。成功构建了orfA和orfC基因的原核表达载体并进行了诱导表达,orfA和orfC重组融合蛋白以包涵体形式存在;采用皮下注射结合耳静脉加强免疫有效地提高了抗体效价,成功制备得到了兔抗orfA和兔抗orfC血清,抗体效价达1∶8 000～1∶10 000;通过Western blot法,利用上述抗血清分别检测到了原核表达的目的蛋白及酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白。【结论】制备得到的抗orfA和抗orfC多克隆抗体具有很好的特异性,能够用于原核表达、酵母和肿瘤细胞中表达的目的蛋白的Western blot检测。 相似文献
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[目的]克隆、表达牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(ompH)并鉴定其抗原性.[方法]扩增牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的ompH基因,构建原核表达载体pET28a - ompH,转化大肠杆菌BL21( DE3)并诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达目的蛋白,利用Western blot检测该蛋白的抗原性.[结果]成功克隆、构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的pET28a - ompH原核表达载体.诱导表达蛋白约38 kDa,Western blot检测重组蛋白具有良好的抗原性.[结论]ompH基因的成功表达为重组OmpH蛋白的血清学检测方法的建立、多克隆抗体的制备及疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
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【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。 相似文献
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目的观察六味地黄汤对慢性肾衰大鼠肾组织细胞外基质的影响,探讨其防治肾间质纤维化的可能机制。方法用5/6肾切除大鼠复制慢性肾衰模型,分空白对照组、假手术组、模型组和六味地黄汤组。术后8周,检测各组肾功能指标;HE染色观察肾脏组织病理变化,Masson染色检测肾脏中胶原纤维沉积;免疫组化法检测ColⅠ、ColⅢ、FN在肾组织中的表达;Western blot法检测PDGF-A、PDGF-B在肾组织中的蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐明显升高(P<0.01);与模型组比较,六味地黄汤组24 h尿蛋白(P<0.01)、血尿素氮(P<0.01)和血肌酐(P<0.05)均明显降低。模型组HE和Masson染色显示大鼠肾间质纤维化明显,大量胶原纤维沉积,六味地黄汤组肾间质纤维化程度明显减轻,少量胶原纤维沉积。免疫组化法显示,与假手术组比较,模型组肾组织中ColⅠ、ColⅢ、FN蛋白水平均明显升高(P<0.01);与模型组比较,六味地黄汤组肾组织中ColⅠ、ColⅢ、FN蛋白水平均明显降低(P<0.05)。Western blot法显示,与假手术组比较,模型组肾组织中PDGF-A、PDGF-B蛋白水平均明显升高(P<0.01);与模型组比较,六味地黄汤组肾组织中PDGF-A、PDGF-B蛋白水平均明显降低(P<0.01)。结论六味地黄汤可能通过下调PDGF-A、PDGF-B表达,从而减少肾组织中细胞外基质的积聚而抑制肾间质纤维化。 相似文献
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目的 研究电离辐射对CNE-2细胞自噬活性和EPG5表达的影响.方法 CNE-2细胞用不同剂量电离辐射照射后,透射电镜、qRT-PCR、Western blot分别检测自噬形态、自噬标志物(P62、LC3)及EPG5表达;用RNA干扰技术(siRNA)沉默EPG5基因表达,qRT-PCR及Western blot检测自噬标志物及EPG5表达.结果 电离辐射引起自噬小体数量增加、LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值升高(P＜0.01)、p62蛋白表达增加、EPG5 mRNA表达下调(P＜0.01).EPG5-siRNA转染后EPG5 mRNA表达下调(P＜0.01),P62、LC3Ⅱ蛋白表达升高(P＜0.01).结论 电离辐射可能通过下调EPG5基因表达,阻滞自噬溶酶体形成,从而影响CNE-2细胞自噬水平. 相似文献
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采用PT-PCR扩增Pyk2-kinase基因,定向克隆至转移载体pFastBac HTB,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,转座后利用抗性及蓝白斑筛选阳性克隆获得重组Bacmid/Pyk2-kinase;提取重组杆粒,PCR法鉴定后转染昆虫细胞Sf9包装重组杆状病毒;利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot检测表达情况。最终获得了重组杆状病毒rBac-Pyk2-kinase,实现了Pyk2-kinase在Sf9细胞中的重组表达,其相对分子质量为32 ku,IFA、SDS-PAGE和Western blot检测结果与预期一致。 相似文献
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根据同源序列克隆原理设计一对引物,以绵羊脑组织总RNA的反转录产物为模板,利用RT-PCR扩增绵羊Noggin基因cDNA全长编码区,克隆到pMD-18T载体。测序验证后,提取pT-Noggin质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收目的条带,亚克隆到pET41a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。序列分析表明,绵羊Noggin基因的cDNA全长编码区(GenBank登录号为FJ751853)为699bp,编码232个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸序列同源性达到95%以上。SDS-PAGE结果显示,诱导表达的融合蛋白大小为60ku,与预期蛋白大小一致。Western blot检测结果显示,该蛋白为His融合蛋白。说明成功克隆了绵羊Noggin基因的编码区序列,构建了原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。 相似文献
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淫羊藿苷(Ica)梯度处理人结肠癌细胞HT29,采用MTT法、流式细胞术、Transwell小室检测Ica对HT29细胞增殖、周期、凋亡、侵袭和迁移的影响;蛋白组织学技术寻找Ica作用前后的差异蛋白, Western blot对部分蛋白进行验证。结果表明:Ica能够抑制HT29增殖;阻滞细胞由G_0/G_1期向S期的发展;诱导HT29细胞凋亡;抑制细胞侵袭和迁移; Ica干预24 h后,乙醛脱氢酶2 (ALDH2)和钙离子依赖性磷脂结合蛋白1 (CPNE1)上调, Western blot验证结果一致。这一研究提示Ica可显著抑制HT29细胞的增殖、侵袭和迁移,诱导细胞凋亡,其机制可能与上调ALDH2和CPNE1有关。 相似文献
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猪瘟病毒E2糖蛋白主要抗原域的原核表达及纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验利用PCR方法从pUC18-E2上扩增出E2基因的主要抗原域片段,长为601 bp,将该PCR产物克隆到原核表达载体pET32a上,得到pET32a-e2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,目的蛋白以包涵体形式表达,其分子量42KD左右;Ni亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blot检测.pET32a-e2重组子的构建及蛋白表达与纯化为进一步制备多克隆抗体或单克隆抗体打下了基础. 相似文献
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利用抑制性消减杂交所获得的rMis12表达序列标签(EST),采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术,从大鼠肝脏中克隆到rMis12基因.通过原核重组表达后制备多克隆抗体,并用基因芯片和Western blot方法分别检测rMis12 RNA和蛋白质水平上的表达变化.成功克隆到rMis12基因,其cDNA全长2 604 bp,编码206个氨基酸,生物信息学分析结果显示该基因存在2个保守的磷酸化位点,与小鼠rMis12基因进化关系最近.基因芯片和Western blot检测结果表明,rMis12在正常大鼠肝脏中表达水平持续较低,在2/3肝切除24 h过程中rMis12出现上调表达. 相似文献
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SphK1 mRNA水平采用半定量RT-PCR检测;SphK1蛋白表达水平采用Western blot测定.研究双歧杆菌脂磷壁酸(LTA)对胃癌SGC7901细胞内鞘氨醇激酶1(SphK1)基因和蛋白表达的影响.结果表明,经200、500 μg· mL-1 LTA处理72 h后,SGC7901细胞内SphK1 mRNA... 相似文献
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SBP-box基因在植物响应逆境胁迫中起着非常重要的作用,通过制备华东葡萄(V.pseudoreticulata)转录因子VpSBP16基因抗血清,为深入探究葡萄抗逆相关基因VpSBP16的功能试验提供基础。将已构建的pGEX-VpSBP16原核表达载体转入大肠杆菌中,利用IPTG诱导表达的蛋白作为抗原注射新西兰兔,从而获得VpSBP16基因抗血清,利用Western blot检测手段,以所获得的VpSBP16基因抗血清作为一抗检测毛葡萄‘商-24’叶、茎、花序、卷须和果实不同发育时期的VpSBP16蛋白表达情况。结果表明,原核表达载体pGEX-VpSBP16在大肠杆菌菌株DE3中高效表达,Western blot检测出与预期结果一致的分子量约为87kD的GST-VpSBP16融合蛋白。在新西兰兔的背部及腹股沟注射纯化后的目的融合蛋白获得了免疫-抗原反应良的多克隆抗血清。提取葡萄总蛋白后检测到VpSBP16蛋白表达量在花序中含量最低,而在果实发育的绿果期表达量较高。大肠杆菌表达系统中,pGEX-VpSBP16融合蛋白可以在27℃、0.6 mmol/L IPTG诱导条件下获得高表达。因此... 相似文献
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《福建农业学报》2020,(4)
【目的】构建能在Sf9昆虫细胞中稳定高效表达中华蜜蜂气味受体AcerOr1的重组表达载体,并对其功能进行分析。【方法】将目的基因AcerOr1和昆虫表达载体pIB/V5-His载体用Bam HI和EcoRI做双酶切,通过T4DNA连接酶构建成含目的基因AcerOr1的表达载体pIB/V5-AcerOr1。将重组表达载体用脂质体转染的方法转染至Sf9细胞中,利用免疫荧光和Western blot检测AcerOr1蛋白的亚细胞定位和表达情况;利用全波长多功能酶标仪检测该受体对4种花香物质刺激后细胞内Ca~(2+)浓度的变化。【结果】成功构建重组表达载体pIB/V5-AcerOr1并建立稳定转染细胞系;Western blot结果证明重组表达载体能在昆虫细胞Sf9中表达;免疫荧光显示重组表达载体在Sf9细胞膜上表达,与预测结果一致。转染pIB/V5-AcerOr1的细胞受花香物质月桂酸(Lauric acid)、亚麻酸(Linolenic acid)、α-松油醇(α-Terpineol)、十一酸(Undecanoic acid)刺激时,均能引起细胞内Ca~(2+)浓度升高。【结论】构建的重组表达载体pIB/V5-AcerOr1能在Sf9细胞中稳定表达,并具有对气味分子的识别功能。 相似文献