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1.
《江苏农业学报》2017,(5)
Viperin蛋白是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,广泛存在于各类动物体内,在进化上高度保守。本研究以鸭外周血淋巴细胞为原材料,通过RT-PCR扩增得到viperin基因,同时构建真核表达质粒p EGFP-N1-viperin,转染至DF-1细胞,用坦布苏病毒攻击后,检测该病毒在转染质粒组和转染空载体组细胞中的增殖情况。结果表明,鸭viperin基因开放阅读框为1 092 bp,编码蛋白由363个氨基酸构成。转染结果显示,viperin基因在DF-1细胞中成功表达。坦布苏病毒攻击后,与转染空载体组相比,转染p EGFP-N1-viperin组显著抑制了坦布苏病毒在DF-1细胞中的增殖。说明鸭Viperin蛋白作为抗病毒蛋白,具有良好的抑制坦布苏病毒增殖的作用。本试验结果为鸭Viperin蛋白抗病毒生物学功能的进一步研究奠定了良好基础。 相似文献
2.
《江苏农业学报》2017,(2)
为了探讨原核表达的坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白对于坦布苏病毒感染的免疫保护作用,利用IPTG诱导重组大肠杆菌表达坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白,Anti-FLAG M2 Affinity Gel纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。经SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化后坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白仅有单一目的条带。免疫组小鼠血清ELISA效价均达4.67±0.11(lg10)。攻毒保护试验结果表明,免疫组小鼠体质量在攻毒9 d后高于对照组,荧光定量RT-PCR检测结果显示,攻毒后免疫组小鼠脑、肝脏、脾脏组织中坦布苏病毒核酸含量均低于对照组。表明使用原核表达的坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ/Ⅱ蛋白免疫可诱导产生高水平抗体,并提供良好的免疫保护力,为开发有效的坦布苏病毒亚单位疫苗提供依据。 相似文献
3.
旨在探究脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是否通过内吞途径以及通过何种内吞途径感染细胞,分别采用内吞途径抑制剂、网格蛋白抑制剂、巨胞饮途径抑制剂和肌动蛋白抑制剂作用于Hela细胞后接种EMCV,通过TCID_(50)、qRT-PCR和Western blot等方法检测病毒感染是否受影响。结果显示,内吞途径抑制剂和肌动蛋白抑制剂作用于Hela细胞后,TCID_(50)、qRT-PCR和Western blot等检测结果提示EMCV的感染受到抑制。表明EMCV可通过肌动蛋白参与的内吞途径感染Hela细胞。 相似文献
4.
[目的]拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础.[方法]取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用.[结果]DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70).含重组质粒pET32a-HSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应.以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染.[结论]HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计. 相似文献
5.
鹅源坦布苏病毒SHYG株的分离与鉴定 总被引：2，自引：2，他引：0
【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增生。【结论】坦布苏病毒SHYG株对雏鹅有较强的致病性。 相似文献
6.
自肝脏表现不规则出血的白羽半番肉鸭脏器中分离获得1株病毒(命名为ZZ40株),经(RT-)PCR检测为鸭坦布苏病毒,可被鸭坦布苏病毒高免阳性血清特异性中和。应用鸭坦布苏病毒特异性引物从该株病毒基因组中成功获得结构蛋白基因片段,该片段与近年来我国分离的禽源坦布苏病毒株核酸序列同源性均在99.1%以上,而与蚊媒源坦布苏病毒MM-1775株同源性仅为88.6%;分子进化分析表明该株病毒与BYD-1等近年来的鸭坦布苏病毒分离株共处于一个进化分支。以上结果表明,我国白羽半番肉鸭存在坦布苏病毒感染,且该分离毒株的抗原性与我国早期分离于种(蛋)鸭的坦布苏病毒差异不明显。 相似文献
7.
《福建农业学报》2015,(11)
对禽坦布苏病毒非结构蛋白NS1基因进行原核表达,并进行生物学活性鉴定。将表达成功具有生物学活性的重组蛋白经纯化后,作为抗原包被ELISA平板,通过条件优化,建立检测禽坦布苏病毒血清学检测方法。结果表明,表达的NS1重组蛋白大小约为60kd,该蛋白经Western blot检测具有良好的生物学活性。将该重组蛋白纯化后包被ELISA板建立检测禽坦布苏病毒血清学间接ELISA方法,该方法优化后的参数为2.5μg·mL~(-1)包被ELISA板;一抗(鸭血清)血清稀释度为1∶100;酶标二抗为1∶3 000。本研究建立的方法特异性强,批内和批间重复性较好。用建立的间接ELISA方法对坦布苏病毒灭活苗免疫鸭血清和自然感染鸭血清进行检测,结果表明,本研究建立的NS1-ELISA不能用于区分禽坦布苏自然感染和疫苗免疫血清的鉴别诊断。 相似文献
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10.
甲基转移酶(methyltransferase,MTase)是鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白5的重要功能基团,在病毒复制及致病过程中发挥重要作用.为了对鸭坦布苏病毒甲基转移酶进行真核表达,并对其生物学功能进行鉴定,以GenBank中收录的DTMUV JS804株基因序列为模板,设计针对MTase的特异性引物,提取TMUV RNA,反转录得到cDNA,以其为模板进行扩增,得到MTase的基因片段,然后亚克隆至pCMV-Flag真核表达载体中,构建重组质粒pCMV-Flag-MTase,提取去除内毒素的重组质粒,并转染至BHK-21细胞,通过间接免疫荧光观察和Western Blot鉴定该蛋白的表达.结果显示,质粒pCMV-Flag-MTase经双酶切鉴定证明构建正确,通过间接免疫荧光与Western Blot检测,重组质粒在BHK-21细胞内正常表达,表达的蛋白与天然坦布苏病毒MTase具有相同的反应原性. 相似文献
11.
采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞, 并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒;用坦布苏病毒特异引物扩增为阳性, 序列测定与分析结果显示分离毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上。上述结果表明分离毒（SN01）可能是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸡源坦布苏病毒。 相似文献
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重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子 总被引：1，自引：0，他引：1
【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。 相似文献
14.
为了实现鹅坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)结构域Ⅱ在大肠杆菌中的表达并对其进行免疫学鉴定,根据鹅坦布苏病毒JS804株囊膜蛋白基因序列,利用人工合成法获得鹅坦布苏病毒囊膜蛋白结构域Ⅱ编码基因并引入限制性酶切位点,片段大小为507 bp。将合成的基因片段克隆入pGEX-4t-1原核表达载体中,构建重组表达载体pGEX-EII并转化至BL21(DE3)中。通过优化表达条件获得重组蛋白质并进行免疫学鉴定。结果显示,重组蛋白质分子量约为4.4×104,Western-blot和间接免疫荧光检测结果表明重组蛋白质具有良好的免疫原性。 相似文献
15.
【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。 相似文献
16.
【目的】筛选稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1）,并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统,检测 DF-1 细胞系中的 Cas9 核酸酶活性。【方法】将携带 Cas9 蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染 293T 细胞包装慢病毒,收集慢病毒 Cas9 上清液感染 DF-1 细胞,经抗生素筛选得到稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,分别用 PCR 和 Western blot 验证阳性 DF-1 细胞表达 Cas9 蛋白的情况;选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的 sgRNA 序列,将 sgRNA 退火产物克隆至 pYP152 构建 sgRNA 表达载体,并在 sgRNA 靶位点两端设计引物扩增 OVA 基因靶片段,将靶片段克隆至报告载体 pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ,以破坏 mCherry 蛋白的表达,之后再将 sgRNA 表达载体与 SSA 报告载体共同转染稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对 mCherry 蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到 27 株稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,采用 PCR 扩增稳转细胞基因组,结果显示这些细胞具有 Cas9 蛋白基因序列,Western blots 试验结果显示上述稳转细胞株均表达 Cas9 蛋白;sgRNA 表达载体与 mCherry-SSA 报告载体共转后,通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中 mCherry 蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,可为后续在稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。 相似文献
17.
在对鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位分析的基础上,将已经筛选出的8条抗原性良好的多肽采用柔性肽拼接,转入T载体中。将酶切回收的串联基因(命名为TEM)克隆于表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-TEM,将该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导后进行超声裂解,对融合蛋白进行可溶性分析、Western blotting分析和免疫原性分析。重组质粒p ET32a-TEM的酶切和测序结果表明,TEM串联基因已成功插入到p ET32a原核表达载体中;表达的p ET32a-TEM融合蛋白分子质量约为38 000,以包涵体形式存在。Western blotting和小鼠免疫试验结果显示,p ET32a-TEM融合蛋白与鸭坦布苏病毒阳性血清能发生特异性反应,具有良好的抗原性。串联多肽的成功表达,将为鸭坦布苏病血清学检测方法建立、新型工程疫苗的研发奠定基础。 相似文献
18.
《浙江农业学报》2015,(10)
通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-NS5,经双酶切鉴定及测序正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白最终经SDS-PAGE及Western-blotting鉴定。结果显示,NS5融合蛋白分子质量约为120 ku,在诱导后5 h达到表达量高峰,融合蛋白以包涵体形式存在,Western-blotting显示原核表达的蛋白可被兔抗鹅坦布苏病毒血清特异性识别,表明以NS5蛋白为抗原制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性。 相似文献
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坦布苏病毒感染诱导雏鸭体内未折叠蛋白反应 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】检测坦布苏病毒在雏鸭体内诱导未折叠蛋白反应的信号通路（PERK、IRE1和ATF6）,为揭示坦布苏病毒致病机制提供理论基础。【方法】取1日龄SPF雏鸭,腹腔接种坦布苏病毒（JS804株）,于接种后12、24、36和48 h从对照组和攻毒组各取5只剖杀,分别取肝脏、心脏和脑组织,利用组织总RNA提取试剂盒提取各个组织样品总RNA,反转录获得cDNA。根据未折叠蛋白反应的3条信号通路,选取不同通路中的标志性分子,设计合成特异性引物,利用荧光定量PCR方法检测靶基因。以GAPDH为内参基因,采用相对定量法（2-ΔΔCt）,分析靶基因的表达水平。【结果】雏鸭肝脏中坦布苏病毒含量最高,心脏次之,脑最低。对未折叠蛋白反应标志性分子GRP78的检测结果显示,脑和肝脏中GRP78表达量持续升高,并在攻毒后36 h达到顶峰（4.21倍和10.14倍）,心脏中GRP78表达量仅在攻毒后36 h短暂升高（1.32倍）。PERK信号通路标志性分子ATF4表达水平在肝脏和脑中分别从攻毒后24 h和36 h持续升高至攻毒后48 h,并在攻毒后36 h达到顶峰（2.71倍和6.02倍）,心脏中ATF4的表达量则仅在攻毒后36 h时升高（1.57倍）。IRE1信号通路标志性分子XBP1s在肝脏中的表达量升高最为显著（9倍）,而脑中EDEM的表达量升高最为显著（3.87倍）且持续时间最长（从攻毒后12 h至攻毒后48 h）。与对照组相比,ATF6信号通路标志性分子GRP94和XBP1u均出现升高现象,虽然两种蛋白在不同组织中表达量变化的时间点和趋势不同,但均在攻毒后36 h出现峰值。【结论】首次报道了坦布苏病毒感染可在雏鸭体内激活未折叠蛋白反应的3条信号通路,本研究将有助于深入研究坦布苏病毒与宿主之间的相互作用机制。 相似文献
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鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病.为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定.[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析.[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株.该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU·mL-1.测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸.DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的全基因同源性为98.5％ ～99.3％.与最早分离的BYD株等相比,XZ-2012株的基因变异主要分布于E基因、NS1基因、NS2基因和NS5基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力.[结论]本试验成功分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒候选疫苗株的筛选及病毒分子流行病学研究提供了参考信息. 相似文献