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1.
胭脂鱼生长激素基因cDNA的克隆和原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到了胭脂鱼的生长激素(GH)基因cDNA。胭脂鱼生长激素基因的开放阅读框(ORF)均包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于8M尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了相对分子质量为24kDa的单一蛋白带。 相似文献
2.
鲮生长激素基因cDNA的分子克隆和序列分析 总被引：3，自引：2，他引：3
根据生长激素(growth hormone,GH)基因的保守性序列设计1对引物,利用RT—PCR技术从鲮(Cirrhina molitorella)脑垂体组织中克隆出经生长激素成熟肽cDNA片段,将纯化的DNA片段克隆到pUCm—T载体上。克隆的鲮GH cDNA开放阅读框全长567bp,编码由188氨基酸残基组成的生长激素成熟肽。序列分析结果表明,鲮GH成熟肽氨基酸序列与另2种鲮—印鲮(Cirrhina mrigal)和南亚野鲮(Labeo rohita)的成熟肽氨基酸序列同源性分别为87％和83％,与鲤的成熟肽氨基酸序列同源性为96％,并对9个科的17种鱼进行了分子系统进化树分析,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致。本研究所克隆的基因序列和推测的蛋白质序列已登录入GeoBank、EMBL和DDBJ基因库,序列号分别为AF458105和从AAL151107．1。 相似文献
3.
通过构建斜带石斑鱼垂体cDNA文库,克隆了其生长激素(GH)全长cDNA。斜带石斑鱼GH全长cDNA为955bp,编码的多肽为204aa。应用PCR方法把编码GH成熟肽的cDNA片段克隆到表达载体pET-15b,在大肠杆菌BL21(DE3)表达N端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.4mmol·L-1IPTG诱导表达的蛋白约为24kDa,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于6mol·L-1盐酸胍后,用Ni2+-NTA树脂进行亲和分离纯化,纯化产物在SDS-PAGE上表现为一条24kDa的蛋白带。在黑鲷GH放射免疫分析系统中,纯化产物能与黑鲷GH竞争结合GH抗体,表明大肠杆菌表达的斜带石斑鱼GH融合多肽具有GH免疫活性。 相似文献
4.
草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征 总被引：1，自引：1，他引：0
采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。 相似文献
5.
翘嘴鳜生长激素cDNA克隆及其真核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列(收录号:AY155227)设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)脑垂体中克隆了生长激素基因(scGH)编码区序列并对其真核表达载体的构建进行了研究。结果显示:扩增片段全长615 bp,共编码204个氨基酸。该序列与GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列同源性为99.84%。将scGHcDNA序列定向插入pYES2/CT真核表达载体中,经过筛选、酶切和测序,证明重组子中确实插入了翘嘴鳜GH片段。 相似文献
6.
根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSGHR1-2质粒在70 kD处发现诱导的蛋白条带,其表达量分别占细胞蛋白总量的37.6%和20.2%;而构建的pGEX-6P-1-CSGH重组质粒和含有GHR-Ⅰ基因跨膜区的重组质粒(pET-32a-CSGHR1-1、pET-32a-CSGHR1-2和pGEX-6P-1-CSGHR1-1)均未获得表达产物。由此可见,半滑舌鳎GHR-Ⅰ基因的跨膜区可能影响其在大肠杆菌中的表达。研究结果为实现半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ制剂的开发及应用于养殖生产实践奠定基础。 相似文献
7.
鱼类生长激素是一种单一肽链蛋白激素,主要作用是促进机体的生长.采用RT-PCR方法,首次从齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)脑垂体总RNA中克隆出生长激素(gFowth hormone,GH)cDNA的开放阅读框ORF(open reading frame)序列,全长633bp.经DNA Star软件分析,该基因编码210个氨基酸,分子量为23.55 kD,等电点为5.46,含有1个疏水区和1个N-糖基化位点.空间结构含有4个α螺旋和4个β折叠,形成2个二硫键.序列比较发现,齐口裂腹鱼GH与草鱼、鲤的GH同源性分别为99.8%、99.4%;与黄鳝、花鲈和大黄鱼的GH同源性分别为57.4%、63.5%和64.2%. 相似文献
8.
本研究旨在克隆梭鲈(Sander lucioperca)生长激素(growth hormone, GH)基因, 探究其序列特征及其表达量与梭鲈生长的相关性, 以期为梭鲈生长的分子机理研究鉴定基础。研究采用 RACE 技术从梭鲈垂体中克隆了 GH 基因, 其 cDNA 全长为 926 bp, 包含 74 bp 的 5′非翻译区、237 bp 的 3′非翻译区和编码 204 个氨基酸的开放阅读框。 氨基酸多重比对发现, 梭鲈 GH 与黄金鲈(Perca flavescens)、河鲈(Perca fluviatilis)的氨基酸序列相似性分别为 97.04%和 94.05%, GH 基因在鱼类和哺乳动物中都存在四个保守的半胱氨酸残基位点。应用实时荧光定量 PCR 技术分析了 GH 基因在梭鲈各组织和体重极端差异个体间的表达特征, 结果显示, GH 基因在梭鲈各组织中均有表达, 垂体中相对表达量最高, 脑次之, 与其他组织相比差异极显著(P＜0.01)。GH 基因表达量与梭鲈体重呈正相关, 4 个组织中 GH 基因表达量均为体重极大组高于极小组, 其中垂体和脑中差异极显著(P＜0.01), 肌肉中差异显著 (P＜0.05)。因此, GH 基因可以作为梭鲈生长候选基因用于分子选择。本研究结果可为进一步解析 GH 基因调控梭鲈生长发育的分子机制研究提供参考。 相似文献
9.
Ghrelin是联系生殖和能量代谢的重要桥梁信号分子,通过克隆黄鳝(Monopterus albus)的ghrelin基因并对其基因结构和功能进行了初步分析;运用c DNA末端快速扩增技术获得了黄鳝ghrelin基因的c DNA序列和DNA序列全长。结果表明,黄鳝ghrelin基因c DNA全长552 bp(Gen Bank accession no.JX122807),包括115 bp的5'端非编码区、324 bp的完整开放阅读框以及113 bp的3'端非编码区;DNA序列全长1323 bp,由3个内含子和4个外显子构成,内含子剪切位点具有典型识别核苷酸GT/AG,3个内含子分别为594 bp、84 bp和93 bp,4个外显子长度分别为229 bp、78 bp、112 bp和133 bp。氨基酸序列分析显示,ghrelin基因推导的Ghrelin蛋白前体原(propreghrelin)序列由26 aa的信号肽、19 aa的成熟肽以及C端氨基酸残基等构成;其中,成熟肽第3位为丝氨酸(Ser3),是Ghrelin的酰基化位点;C端氨基酸残基序列极可能包括与Ghrelin成熟肽功能相互拮抗的肥胖抑制素(Obestatin)。氨基酸的同源性及进化关系分析表明,黄鳝与某些鲈形目鱼类的蛋白前体原存在高度相似性,且在进化上黄鳝与较高级的鲈形目、鲽形目鱼类聚为一支。ghrelin基因结构及其蛋白质某些氨基酸残基序列的高度保守,预示着Ghrelin在脊椎动物中有着重要的生理功能与类似的作用机制。 相似文献
10.
锯缘青蟹蜕皮抑制激素cDNA的分子克隆及其表达分析 总被引：5，自引：1，他引：5
根据近缘种类同源序列设计简并引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术,首次扩增获得锯缘青蟹(Scylla serrata)眼柄组织中编码蜕皮抑制激素(MIH)成熟肽全长cDNA序列及部分信号肽序列。将该序列克隆到pUCm—T载体上进行序列测定。结果表明,编码锯缘青蟹MIH成熟肽的cDNA由234个碱基组成,由此推测MIH成熟肽含78个氨基酸残基。该序列不仅与其它短尾类甲壳动物的MIH氨基酸序列具有高度的同源性(79％～9l％),还与该激素同一家族的性腺抑制激素、大颚器抑制激素的氨基酸序列具有较高的相似性。RNA斑点杂交结果显示,MIH基因在眼柄神经节及脑组织中均有表达,而在肌肉、中肠腺中不表达。 相似文献
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利用同源克隆的方法从鲢（Hypophthalmichthys molitrix）的肝脏中克隆出抗菌肽 Hepcidin cDNA（GenBank 登入号 KF312213）后,通过 pET32a（＋）构建含抗菌肽 Hepcidin 的重组质粒的 pET-Hep/ Rosetta 菌株,在37℃、28℃和16℃下分别用0.5 mmol·L -1和1.0 mmol·L -1 IPTG 诱导表达,产物用 Ni SepharoseTM 亲和层析柱纯化并进行体外抑菌试验。鲢 Hepcidin cDNA 总长度755 bp,ORF 为282 bp,5′UTR 为108 bp,3′UTR 为365 bp,编码93氨基酸,信号肽24个氨基酸,前域42个氨基酸和成熟肽27个氨基酸。pET-Hep/ Rosetta 在28℃和16℃主要是可溶性表达,37℃主要是包涵体表达。纯化的产物经15％ SDS-PAGE 电泳验证为目的产物。目的产物、pET32/Rosetta 产物以及氟苯尼考的体外抑菌试验表明,目的表达产物对无乳链球菌（ Streptococcus agalactiae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等具有很好的抑菌效果。 相似文献
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从鲤(Cyprinus carpio)肝脏总RNA中成功地克隆和诱导表达了胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因,并用间接ELISA法和Western-blot对其融合蛋白的多克隆抗体的效价和特异性进行了分析。结果表明,克隆的鲤IGF-Ⅱ基因与已报道的序列相比,有1个位点发生同义突变;经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,表达量占菌体总量的35%。经ELISA测定,制备的抗体效价为6400。Western blot分析表明,抗血清能与重组蛋白发生特异性反应 相似文献
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Molecular cloning and expression of salmon pituitary hormones 总被引：2，自引：0，他引：2
Choy L. Hew Khiet Ye Trinh Shao Ju Du Shiduo Song 《Fish physiology and biochemistry》1989,7(1-6):375-380
A cDNA library was prepared from chinook salmon pituitaries. Growth hormone (GH), prolactin (PRL) and the β subunit of gonadotropin
(GTH) genes were screened using synthetic oligonucleotides as probes. Full size cDNA clones coding for these polypeptide hormones
were isolated and characterized. The cDNA sequences for PRL and βGTH have been reported earlier from our laboratories. The
cDNA clone for GH contains 1148 bp and codes for a preGH of 210 amino acids. The chinook salmon GH, reported in the present
investigation, differs from chum salmon GH in only 1 amino acid, and from coho salmon GH in 5 amino acids. Plasmids containing
modified nucleotide sequences coding for GH, PRL and βGTH were constructed individually into an expression vector using the
heat-inducible λ pL promotor. Mature PRL, GH and unglycosylated βGTH were expressed in the bacteria at elevated temperature. 相似文献
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Laida Ramos Tania Rodríguez‐Ramos Alberto Huberman Mario Pablo Estrada 《Aquaculture Research》2013,44(7):1066-1075
To date, no hormonal treatments are available for control of shrimp reproduction and only eyestalk ablation is of practical use. The crustacean hyperglycemic hormone (CHH) is the most abundant neuropeptide of the eyestalk CHH family. It plays an important role in the regulation of hemolymph glucose levels, as its principal function, but it is also implicated in additional physiological processes such as moulting and reproduction. In the present study, the cDNA encoding Litopenaeus schmitti (Burkenroad) mature CHH was cloned into the Escherichia coli pTYB2 expression vector. Using this strategy we have obtained, for the first time, the recombinant CHH from L. schmitti with its C‐terminus fused to an intein tag. The expected fused protein of about 63 KDa was expressed in E. coli forming inclusion bodies. It was purified in a soluble form by electroelution following molecular size fractionation in sodium dodecil sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. The ability of the chimeric CHH protein to elevate glucose levels in the hemolymph of the eyestalk‐ablated Litopenaeus vannamei (Boone) shrimps indicates that its biological activity as hyperglycemic protein is preserved. The results provide an alternative tool to obtain soluble recombinant proteins from the CHH family of neuropeptides to get a better understanding of shrimp endocrinology. 相似文献
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文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤C1q基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸。在文蛤C1q(MmC1q)蛋白中,C1q结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的C1q结构域均具有较高的同源性。通过荧光实时定量PCR,MmC1q mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高。在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,C1q相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmC1qmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍。包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmC1q重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性。 相似文献
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中华绒螯蟹精巢特异表达蛋白DMRT-like:抗体制备及免疫鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
Dmrt是性别调控因子Doublesex和Mab-3的相关基因,近年报道了中华绒螯蟹EsDmrt-like只在精巢中表达,为了验证EsDMRT-like蛋白是否在中华绒螯蟹精巢中特异表达及其功能,根据中华绒螯蟹EsDmrt-like基因序列,构建重组质粒pET-32a-EsDmrt-like,转化大肠杆菌BL21,经融合表达和SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为46ku.利用Ni柱亲和纯化融合蛋白免疫家兔,制备获得EsDMRT-like多克隆抗体.Western-blotting检测表明该抗体既能特异地识别重组蛋白,又能特异识别精巢中EsDMRT-like蛋白,并且该抗体仅在精巢中检测到EsDMRT-like蛋白的表达,分子量约为52 ku,为预期单体分子量的二倍.Western-blotting检测变性后精巢总蛋白,该抗体能识别52和34 ku两条条带,证明了二聚体的存在.这一结果暗示EsDMRT-like可能通过形成二聚体形式调控中华绒螯蟹精巢发育. 相似文献
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蜕皮抑制激素(molt—inhibiting hormone，MIH)属甲壳动物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)家族。MIH抑制Y-器官蜕皮激素的合成。以中华绒螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)眼柄总RNA为模板，根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Eriocheir japonica sinensis molt—inhibiting hormone-1，Ers—MIH1)基因序列设计引物，用RT—PCR的方法获得了Ers—MIH1基因成熟肽的cDNA片段。序列分析表明，Ers—MIH1基因成熟肽编码区含有228bp，编码75个氨基酸残基，与已发表的序列一致。将该cDNA片段插入到中间载体pMD18-T中，酶切后再将该片段插入到pGEX-4T-1表达载体中，构建成表达质粒pGEX-4T—MIH1。在BL21细胞中经IPTG诱导表达，得到GST—MIH1的融合蛋白。SDS—PAGE分析表明，经0．1mmol／L IPTG诱导4h，发现大量GST—MIH1融合蛋白表达，在分子量(Mr)为34kD处有1条特异的蛋白质条带。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1融合蛋白的成功表达为进一步深入研究MIH在中华绒螯蟹蜕皮过程中的作用机制奠定了基础。 相似文献