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1.
猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达 总被引：2，自引：2，他引：0
猪圆环病毒是引起猪多系统衰竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO-HTb,转化BL21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒系统表达及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR方法扩增猪圆环病毒2型(pcv-2)中的缺失核定位序列的ORF2基因,将其克隆到Bac-N-Blue杆状病毒表达系统的pMelBacB载体中,得到阳性重组质粒pMel-ORF2。将其与Bac-N-Blue DNA体外重组,在脂质体的介导下,转染处于对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒并在Sf9细胞上表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光法(IFA)鉴定表明,Cap蛋白在昆虫-杆状病毒系统获得了表达,为Cap蛋白作为pcv-2检测抗原进行猪圆环病毒特异性抗体的检测提供了物质基础。 相似文献
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猪圆环病毒是引起猪多系统哀竭综合征的重要病原,全病毒培养十分困难,避开培养病毒,得到大量的检测抗原,对诊断本病有着重要的意义。本研究对疑似猪圆环病毒2型感染猪脾脏提取病毒DNA,进行套式PCR扩增获得了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列,并将扩增片段定向插入质粒载体pPRO—HTb,转化BE21大肠杆菌后,构建了表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组原核表达系统。经IPTG诱导,对表达产物经SDS—PAGE和Western—blot分析,表明ORF2基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物以包涵体形式存在于菌体中,通过提取包涵体,获得了初步纯化的ORF2蛋白,为进一步利用PCV2 ORF2蛋白抗原进行PCV血清学检测提供了基础。 相似文献
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通过PCR方法扩增完整的鸭圆环病毒Cap基因,按正确的阅读框架将其克隆入pFastBacTM HTB杆状病毒载体,将筛选的阳性重组载体pF-CP转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染Sf9昆虫细胞,72h后获得重组杆状病毒。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,表达的蛋白与原核表达Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反应原性,为进一步研究Cap蛋白的功能奠定基础。 相似文献
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[目的]表达出猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap),为PCV3免疫学检测方法建立基础.[方法]用PCR技术扩增PCV3-Cap基因片段,与pET-32a原核表达载体定向连接,构建重组原核表达质粒.经大肠杆菌表达后,通过SDS-PAGE来检测目的蛋白的大小与存在方式,并用小鼠抗PCV3-Cap抗体进行Western blot检测.[结果]用pET-32a原核表达系统成功表达出重组PCV3-Cap融合蛋白,其多以包涵体形式存在,纯化后的融合蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清发生特异性结合,显示出良好的免疫反应性.[结论]原核表达出具有良好免疫反应性的PCV3 Cap. 相似文献
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《南京农业大学学报》2014,(2)
根据禽腺联病毒Rep基因序列设计2对引物,分别扩增出Rep78和Rep52基因,将其克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacDual,获得重组穿梭质粒pFastBacDual-Rep,将其转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组病毒表达质粒rBacmid-Rep。在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-Rep。SDS-PAGE结果分析表明,Rep78、Rep52均获得了表达,Western blot结果显示表达的重组蛋白能够与Rep52多抗反应,具有良好的反应原性。结论:禽腺联病毒的非结构蛋白Rep78、Rep52基因在昆虫细胞中获得了成功表达。 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达. 相似文献
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应用杆状病毒表达系统,将猪圆环病毒2型 ORF2 基因插入供体质粒pFastBacTMDual pH启动子控制下的多克隆位点,引入EGT信号肽取代 ORF2 原有核定位信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以便于后期的纯化.将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体,提取重组Bacmid质粒.将阳性重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞,72 h收集培养上清液获得重组杆状病毒.间接免疫荧光试验和Western-blot表明,该重组杆状病毒可以在昆虫细胞实现猪圆环病毒2型Cap蛋白的分泌表达. 相似文献
10.
为了提高陕西地方性猪圆环的防治力,研究对一陕西地方猪圆环病毒2型毒株进行了Cap基因扩增,将扩增到的基因与p ET-32a构建表达载体,在BL21表达菌中进行原核表达,并应用western-blotting对其抗原性进行检测。结果显示,我们扩增到了大小为489 bp左右的基因片段,该基因与猪圆环病毒2型标准株Cap基因的最高核苷酸同源性约为93. 9%,氨基酸同源性约为84. 7%;其蛋白分子量约为18 ku,该蛋白能与猪圆环病毒2型阳性血清特异性结合,具有良好的抗原性。 相似文献