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为比较山羊痘病毒贵州分离株P32基因与国内外分离株的关系,并获得P32蛋白,应用PCR方法从贵州山羊痘病毒分离株的核酸样本中扩增出P32基因片段,将PCR产物克隆至pMDl8-T载体,对重组质粒进行了基因序列测定.将测定的P32基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank中相应序列作比较,同源性分别达到99.4%和98.4%,表明山羊痘病毒的P32基因具有高度保守性.将P32基因克隆至原核表达载体pET-28a,成功构建重组表达质粒pET-28a-P32/LD,转化至大肠杆菌BL2l(DE3)进行诱导表达.SDS-PAGE检测显示,重组细菌在35.5 kDa处表达一条特异性的蛋白带,而阴性对照未见这条蛋白带;Western-Blotting检测证实,这条蛋白带能与山羊痘高免血清反应而显示其免疫学活性. 相似文献
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[目的]对绵羊痘病毒当地流行毒株的分离和其结构蛋白P32基因的克隆和序列进行分析,明确引起新疆本地绵羊流行痘病的病毒种类,掌握当前流行毒株的变异情况,为绵羊痘的预防控制及将来研制高效安全疫苗提供科学依据.[方法]将两例疑似患有羊痘的绵羊肺脏组织病料接种于MDBK细胞进行病毒分离,细胞病变组织经处理后通过电子显微镜观察分离病毒.以分离病毒基因组DNA为模板,通过PCR扩增绵羊痘病毒结构蛋白P32基因,并对目的基因进行克隆和基因序列和蛋白生物信息学分析.[结果]两例病料组织接种MDBK细胞后均产生明显的细胞病变,电子显微镜观察可见到约200 nm大小、椭圆形有囊膜的典型痘病毒粒子.对两株病毒表面膜结构蛋白P32基因PCR扩增均可获得与预期大小一致的约972 bp片段,氨基酸序列分析表明分离毒株SPV/Miquang/2013和SPV/Kuche/2013病毒P32基因与绵羊痘病毒参考株同源性分别达96.9;～99.4;和97.5;～100;,生物信息学分析发现SPV/Miquang/2013株P32蛋白有两个关键氨基酸位点发生变异,即第78位谷氨酸突变为赖氨酸,第293位异亮氨酸突变为苏氨酸.[结论]从疑似病例中分离到两株病毒,通过电镜观察及P32基因扩增测序,与其他羊痘病毒比对后鉴定分离毒株为绵羊痘病毒,分别命名为SPV/Miquan/2013和SPV/Kuche/2013.SPV/Miquan/2013的P32蛋白同其他绵羊痘病毒的两个氨基酸位点发生明显突变. 相似文献
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为研究山羊痘病毒的059蛋白,本研究用PCR技术扩增山羊痘病毒THX株059基因,并构建了融合表达His标签的原核表达载体,测序鉴定并分析了059基因的核苷酸序列特征和推测的氨基酸序列结构特征,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定其蛋白表达情况。结果成功扩增并构建了山羊痘病毒059基因的原核表达载体PET-42b-059,THX株059基因全长为765 bp,与参考株的相似性高达99. 34%,与山羊痘病毒在亲缘关系上较近,而与疙瘩皮肤病病毒与绵羊痘病毒的亲缘关系较远。059蛋白会长255aa,由多个α螺旋和β片层交错构成,分子量大小为29 KDa,SDS-PAGE结果显示其以包涵体的形式表达,大小与理论相符,Western Blot结果证明059蛋白与His标签进行了融合表达。结果表明059蛋白可以较好原核表达,为进一步研究该蛋白的其他生物学特性奠定了基础。 相似文献
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根据羊痘病毒基因组设计引物,建立了检测羊痘病毒P32基因的PCR方法,并扩增了疫苗毒株、标准毒株、贵州分离株的P32基因;应用生物学软件对山羊痘和绵羊痘病毒P32基因的酶切位点进行分析,选择合适的限制性内切酶对P32基因进行酶切.结果表明,以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量和纯度上均高于Trizol法,更有利于PCR扩增;所建立的PCR方法对细胞感染物及山羊痘疹样本均能扩增出特异性的目的DNA条带;软件分析选择限制性内切酶Hinf I对羊痘病毒P32基因的PCR产物进行酶切鉴定,可以有效区分山羊痘病毒和绵羊痘病毒. 相似文献
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《西南农业学报》2017,(5)
【方法】利用PCR方法对绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)新疆分离株MO-XJ p74基因进行扩增、克隆及测序,分析其分子特征。将P74蛋白抗原集中区编码序列亚克隆至表达载体p ET-32a(+),构建重组表达载体p ET-32a(+)-p74C,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达。【结果】MO-XJ p74基因全长2016 bp,编码671个氨基酸;对编码的氨基酸序列分析发现,该蛋白不含信号肽序列,9~31位氨基酸序列含有1个跨膜区,有16个N-糖基化位点、7个N-酰基化位点、17个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点及5个蛋白激酶C磷酸化位点。同源性分析显示MO-XJ P74蛋白氨基酸序列与标准株MO-SC01氨基酸序列同源率为86.5%,其羧基端为P74蛋白抗原集中区。SDS-PAGE检测结果显示,表达的P74蛋白抗原表位集中区片段对分子质量约为35.5 k Da,与理论值相符;Western blot分析表明重组P74蛋白具有较强的反应原性。【结论】本研究为进一步筛选MO亚单位疫苗及血清学诊断的候选抗原奠定了前期基础。 相似文献
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禽呼肠孤病毒血清学相关性及S3基因序列同源性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
采用血清学交叉中和试验方法,分析了4株禽呼肠孤病毒株CL(鸡源禽呼肠孤病毒)、YH和YB(鸭源禽呼肠孤病毒)及S1133(禽呼肠孤病毒标准株)之间抗原的相互关系;并对CL株的S3基因进行克隆测序,用DNAsis和Prosis等分析软件进行序列比较及推导氨基酸序列分析.结果表明:4株禽呼肠孤病毒株之间具有共同的群特异抗原,但不同病毒株间存在中和抗原位点的不对称性;血清学相关性与S3基因序列及其推导的σB蛋白氨基酸序列同源性不一致,表明禽呼肠孤病毒诱导机体产生特异性中和抗体的病毒蛋白不止σB蛋白一个,σB氨基酸序列同源性与血清学相关性没有必然的直接联系. 相似文献
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为了开发出一种可行的羊痘基因疫苗,尝试用羊P32基因与CD58基因建立共表达载体.试验根据GenBank中收录的羊痘病毒(GPV)P32和羊CD58基因组序列,设计了扩增GPV P32基因和CD58基因的特异性引物,运用PCR技术从GPV中扩增出P32基因,从羊的外周血中扩增出CD58基因,并将其分别克隆到pMD18-T载体,测序正确.将P32基因去掉后端疏水区一段与CD58基因先后克隆至载体pBudCE4.1,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定和测序正确,且读码框正确.说明成功获得了真核共表达质粒pBudCE4.1/CD58/P32. 相似文献
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通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头,串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE,将其克隆到原核表达载体pET-32中,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒,构建pET32-mE质粒;用IPTG在不同条件下诱导表达,确定最佳表达条件,表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明,重组蛋白是分子质量为41ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为37℃、诱导4h时目的蛋白的表达量最大,约占菌体的32%。Western-blotting试验表明,目的蛋白可被羊痘血清识别。 相似文献
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［目的］研制小反刍兽疫羊痘活载体疫苗。［方法］利用PCR技术扩增小反刍兽疫病毒H基因,克隆到pGEM-T easy载体,Nhe Ⅰ和Hin-d Ⅲ双酶切重组质粒,将目的片段插入到真核表达载体pEGFP-N1-P7.5中,得到重组载体pEGFP-N1-P7.5-H,重组载体Hin-d Ⅲ、NheⅠ双酶切片段EGFP-P7.5 H平末端连接到KpnⅠ 酶切后的载体pUC119-TK中,得到通用转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-H。［结果］经酶切鉴定及PCR扩增检测,表明构建载体正确。pUC119-TK-EGFP-P7.5-H转染羊痘病毒感染的BHK21细胞,48 h后报告基因表达。［结论］该研究为研制小反刍兽疫基因工程活载体疫苗奠定基础。 相似文献
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【目的】明确隆林山羊诱导细胞凋亡DFF45样效应因子c基因（CIDEc）的生物学特性及其表达规律,为揭示CIDEc基因对山羊脂肪代谢的调控机制提供理论依据。【方法】提取隆林山羊背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腹脂和皮下脂肪及努比亚山羊腹脂和皮下脂肪的总RNA,PCR扩增隆林山羊CIDEc基因编码区（CDS）序列,使用Ex-PASy、TMHMM Server v.2.0、ProtScale、NPS@SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测CIDEc基因在隆林山羊和努比亚山羊不同组织器官中的表达情况。【结果】隆林山羊CIDEc基因CDS序列全长为741 bp,共编码244个氨基酸残基,其编码蛋白分子量26.09 kD,不稳定系数48.44,脂肪指数100.7,理论等电点（pI）5.28,属于酸性蛋白,不存在跨膜结构,亲水性较强。隆林山羊CIDEc基因CDS序列与NCBI已公布的山羊CIDEc基因（XM_018038446.1）CDS序列相对比仅有1处碱基发生突变,即第560位点G突变为T,属于同义突变。隆林山羊与绵羊的CIDEc基因CDS序列相似性最高（99.0%）,与小鼠的相似性较低（79.6%）;基于CIDEc基因CDS序列相似性构建的系统发育进化树也显示隆林山羊与绵羊的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系较远。在隆林山羊CIDEc蛋白的二级结构中:α-螺旋占32.38%,β-转角占12.70%,延伸链占13.11%,无规则卷曲占41.80%。CIDEc基因在隆林山羊7个组织器官中均有表达,且在腹脂和皮下脂肪中高表达,极显著高于在其他器官组织的相对表达量（P<0.01）;CIDEc基因在努比亚山羊脂肪组织（皮下脂肪和腹脂）中的相对表达量显著高于在隆林山羊脂肪组织中的相对表达量（P<0.05）。【结论】CIDEc基因在隆林山羊各器官组织中均有表达,以在脂肪组织中的表达水平较高,且其在努比亚山羊脂肪组织（皮下脂肪和腹脂）中的表达水平显著高于在隆林山羊中的表达水平。可见,CIDEc蛋白是脂肪代谢的重要调节剂,与动物体内脂质存储密切相关。 相似文献
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【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2（pleckstrin homology-like domain, family A, member 2）基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分cDNA序列,进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长cDNA序列;利用ORF Finder和ProtParam等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点,基于表达SNP的方法分析该基因在F1代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的cDNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp,其编码140个氨基酸。预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da,等电点为9.18,二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成, 并且包含保守的PH（pleckstrin homology）结构域。③BLAST分析发现,山羊PHLDA2定位于29号染色体,其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。④荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高（P < 0.01),在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且差异不显著（P > 0.05), 在脾中未检测到表达。⑤印记分析表明,PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因,但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。⑥PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著（n = 15,R2=0.855,P <0.01）。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性,但是其印记状况具有组织特异性; PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。 相似文献
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选择与羊同源性较高的牛RERGL基因组序列设计特异性引物,提取黔北麻羊脾脏总RNA,通过RT-PCR技术对RERGL基因进行克隆测序及序列分析.结果表明,成功克隆了黔北麻羊RERGL基因,其cDNA序列646 bp,GenBank登录号JN 671919,编码205个氨基酸.生物信息学分析表明,黔北麻羊RERGL基因蛋白二级结构α-螺旋占40.68％,延伸链占16.18％,无规则卷曲占43.14％;没有跨膜螺旋结构域且没有糖基化位点. 相似文献
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【目的】研究雄性奶山羊Prm1基因的表达规律并克隆该基因,为奶山羊精子发生过程的研究提供分子基础。【方法】利用PCR技术从关中奶山羊睾丸组织中扩增出Prm1基因的全CDS序列,对其进行同源性比较和进化比较。同时用PCR、western blotting及免疫组化技术检测Prm1在不同年龄雄性关中奶山羊睾丸中的表达。将克隆出的奶山羊Prm1基因与pIRES-GFP载体连接构建重组真核表达载体,转染GC1细胞和人的脐带基质细胞检测Prm1基因的超表达情况。【结果】Prm1基因在成年奶山羊睾丸组织中的表达量很高,且只定位于精子头部,在其它时期的睾丸组织中基本不表达。同时扩增得到了关中奶山羊Prm1 基因CDS序列,与其它物种比对,发现其与许多物种具有较高的同源性,与牛的同源性高达97.4%,最后在GC1细胞和人的脐带基质细胞中进行了超表达。【结论】得到了关中奶山羊Prm1基因的表达规律及完整的CDS序列。 相似文献
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生长激素基因在猪羊间的差异 ,通过两对引物 ,分别为P1:5’ -agctggattctttacggctgagcc - 3’和P2 :5’ -tccggaagcaggagagcagaccgtag - 3’ ,P3:5’ -gctgacacctacaaggagtttg - 3’和P4:5’ - gtttgcttgaggatctgtcctg - 3’。对它们的DNA进行聚合酶链反应 ,电泳及序列分析结果表明 :P1-P2和P3-P4引物都能扩增出猪羊DNA样 ,得到大小一致的扩增带 (对应引物的带 ) ,但southern杂交结果的差别很大 ;生长激素基因的碱基组成在猪羊间的差异为 6 5 % ,即猪羊生长激素基因保守性很强 相似文献
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利用Real-time PCR技术,对不同时期文登奶山羊、崂山奶山羊、波尔山羊乳腺组织中Leptin基因的表达进行了检测,并利用亚硫酸盐测序法,分析了其甲基化水平。结果表明:3个品种的山羊在青春期中期Leptin的表达量都较高,妊娠中期表达量急剧下降,此后泌乳期维持在较低水平,在退化期20d以后又恢复到高水平;并且每个品种在不同的时期表达差异均显著(P<0.05),在同一时期不同品种间表达差异均不显著(P>0.05)。甲基化结果表明:3个品种的山羊在青春期中期、妊娠中期、泌乳中期、退化期的Leptin基因甲基化比率均在78.57%～87.14%之间,同一品种不同时期差异均不显著(P>0.05);并且在同一时期不同品种间甲基化差异也不显著(P>0.05)。因此,作者认为这3个品种山羊的Leptin基因的甲基化与其表达均无直接关系。 相似文献