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1.
【目的】研究飞蝗（Locusta migratoria）细胞色素P450（CYP450）第四家族（CYP4）中3个基因的功能。【方法】以飞蝗为材料,依据飞蝗EST数据库P450基因预测序列设计引物,利用 RT-PCR技术克隆飞蝗细胞色素P450基因的cDNA全长序列,命名为CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1（GenBank登录号： KF857162、KF857163和KF857164）。采用实时定量 PCR 技术分析CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗各发育阶段以及不同组织中mRNA的表达水平。应用RNA干扰技术沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1,实时定量 PCR 技术检测基因的沉默效率。应用农药点滴技术测定2龄若虫期飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的毒力,通过SPSS软件分析得出3种杀虫剂的LC30,同时应用该技术研究dsRNA干扰过的飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。【结果】克隆获得了飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,其中CYP4C69开放阅读框1 518 bp,编码506个氨基酸;CYP4C73开放阅读框1 521 bp,编码 507个氨基酸;CYP4DH1开放阅读框1 512 bp,编码 504个氨基酸。对飞蝗不同龄期定量PCR结果分析,发现CYP4C69在若虫末期表达量高于成虫期,CYP4C73和CYP4DH1在飞蝗整个发育阶段均有表达,在若虫初期和末期以及成虫期表达量较高;不同组织的定量PCR结果表明CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均在胃盲囊高表达,CYP4C69和CYP4DH1在脂肪体中高表达。通过RNA干扰,发现CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1均可以被显著沉默。马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯对2龄若虫期飞蝗的毒力测定表明2龄若虫期飞蝗对3种杀虫剂的LC30剂量,分别为59.438、8.215、0.759 μg•mL-1。飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂敏感性试验结果表明,双链RNA沉默CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1后,飞蝗点滴马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂后的死亡率与注射dsGFP的对照组相比,没有显著提高。【结论】获得飞蝗CYP450基因CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1的cDNA全长序列,这些基因均可被双链RNA干扰而沉默,但CYP4C69、CYP4C73和CYP4DH1沉默后,飞蝗对马拉硫磷、毒死蜱和溴氰菊酯杀虫剂的敏感性与对照组相比没有显著提高。 相似文献
2.
【目的】克隆大豆蚜羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究大豆蚜抗药性机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术,克隆了1个大豆蚜羧酸酯酶基因的全长cDNA序列,命名为AgCarE,利用生物信息学软件及网上工具进行序列分析,以pET-21b为载体构建原核表达系统进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因AgCarE（GenBank登录号：JF970181）全长1 946 bp,编码526个氨基酸。羧酸酯酶AgCarE的等电点（pI）为6.08,蛋白活性中心包括3个氨基酸残基（催化三联体）：Ser186、Glu313、His434,5个N-联糖基化位点,具备羧酸酯酶的结构特征,属羧酸酯酶家族（EC: 3.1.1.-）。将该基因编码序列与pET-21b载体重组,经IPTG诱导表达HIS标签融合蛋白、SDS-PAGE分析和Western-blot检测,在大肠杆菌BL21中成功表达约59 kD的AgCarE蛋白,以α-醋酸萘酯为底物,检测表达的羧酸酯酶活性为0.036 mmol/100 μL酶液。【结论】成功克隆、表达了大豆蚜羧酸酯酶蛋白AgCarE,以α-醋酸萘酯为底物,检测表达的羧酸酯酶活性为0.036 mmol/100 μL酶液,有助于进一步了解羧酸酯酶的结构特征及水解作用,为设计研发新型杀虫剂提供可能。 相似文献
3.
棉铃虫羧酸酯酶基因cDNA的克隆、表达及活性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】克隆棉铃虫中肠羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究棉铃虫抗药性机理奠定基础。【方法】制备抗血清,对棉铃虫(Helicoverpa armigera (Hübner))中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,得到编码棉铃虫羧酸酯酶基因的cDNA克隆,利用生物信息学软件和网站进行序列分析,构建原核表达载体进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因hc3(GenBank登录号：GU119888)全长2 896 bp,编码795个氨基酸。羧酸酯酶HC3的等电点pI为3.94,活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体)：Ser204, Glu331, His444;第545—773位包含大量高度重复的Gly,Asp、Glu(GDE区域)构成亲水区。该基因在大肠杆菌BL21中成功表达约100 kD的HC3蛋白,检测表达的羧酸酯酶活性为0.32 mmol/100 μL酶液。【结论】成功克隆、表达了棉铃虫羧酸酯酶蛋白HC3,并发现GDE亲水结构域。为进一步了解羧酸酯酶的三维结构及其水解作用并设计新型杀虫剂提供了可能。 相似文献
4.
橘小实蝇羧酸酯酶基因BdCAREB1的克隆及其表达模式解析 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】在克隆获得橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）1条羧酸酯酶基因全长序列的基础上,解析该基因在橘小实蝇不同发育阶段和组织以及经高效氯氰菊酯饲喂后的表达模式。同时结合之前完成的有关橘小实蝇羧酸酯酶生化特性以及增效剂处理研究结果,综合分析橘小实蝇羧酸酯酶对高效氯氰菊酯作用的应激反应,为明确羧酸酯酶对菊酯类杀虫剂的解毒代谢机制奠定基础。【方法】通过同源序列比对的方法,从橘小实蝇转录组数据中筛选出1条羧酸酯酶基因序列片段,利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）扩增得到该基因的全长cDNA序列;应用生物信息学分析软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、分子量等信息进行预测,并基于最大似然法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树,阐明其分子生物学特征。此外,分别提取橘小实蝇不同发育阶段以及3龄幼虫的中肠、脂肪体、马氏管和气管等组织的RNA,在内参基因稳定性评估筛选的基础上,运用qPCR的方法解析该基因在不同发育阶段和组织间以及药剂处理后的表达模式。【结果】从橘小实蝇转录组数据库中筛选出1条长度为1 028 bp的羧酸酯酶基因片段,通过对5′端和3′端进行RACE扩增分别得到长度为1 073和625 bp的目的片段,经序列拼接和验证后,确定该基因全长为1 872 bp,完整开放阅读框1 710 bp,编码569个氨基酸,推测其蛋白质分子量为63.3 kD,理论等电点6.38。该基因经序列比对命名为BdCAREB1,GenBank登录号为KF539980。基于最大似然法构建的系统发育树显示,该基因编码的蛋白质与双翅目昆虫的羧酸酯酶具有高度的同源性。分析其在不同发育阶段的表达模式发现,BdCAREB1在3龄幼虫期的表达量最高,其次为成虫期,而在卵期的表达量最低。在橘小实蝇3龄幼虫不同组织间的定量分析结果表明,BdCAREB1在脂肪体中表达水平最高,其次在中肠和马氏管的表达水平较低且接近,而在气管的表达量最低。经饲喂0.33 μg?g-1（药剂/饲料）的高效氯氰菊酯后检测BdCAREB1在整虫及组织间的表达情况发现,该基因在幼虫以及脂肪体中的表达量显著上调。【结论】橘小实蝇BdCAREB1的表达具有发育阶段和组织特异性,在幼虫期和脂肪体的表达量最高,并对高效氯氰菊酯处理表现出明显的应激反应,具有可诱导性。结合此前完成的橘小实蝇羧酸酯酶活性测定及增效剂研究结果,分析该基因很可能参与橘小实蝇对高效氯氰菊酯的解毒代谢。 相似文献
5.
飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。 相似文献
6.
【目的】对重要农业害虫中华稻蝗（Oxya chinensis）羧酸酯酶（carboxylesterases,Ces）家族基因进行生物信息学分析,并对部分基因的组织表达特性进行研究,为揭示中华稻蝗Ces基因功能及研发新的分子靶标提供依据。【方法】基于中华稻蝗转录组数据库,通过关键词搜索获得Ces基因序列,采用生物信息学方法进行比对拼接、氨基酸序列推导和开放阅读框分析,选择全长序列构建系统发育树,采用在线软件分析中华稻蝗Ces氨基酸序列结构、理化性质、信号肽和N糖基化位点等特征。采用实时定量PCR技术,通过geNorm 与Normfinder 软件分析4个候选内参基因β-肌动蛋白（β-actin）、延长因子（EF1α）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和核糖体蛋白49（RP49）表达稳定性,筛选中华稻蝗5龄若虫不同组织部位最适内参基因并检测10个羧酸酯酶基因在不同组织部位相对表达量。【结果】从中华稻蝗转录组数据库搜索获得Ces基因cDNA片段180个,经筛选获得28个Ces基因全长序列进行生物信息学分析。推导的氨基酸序列与其他昆虫物种的聚类分析结果显示,中华稻蝗28个Ces分布于4个功能簇中,其中A簇直翅目和部分双翅目昆虫α酯酶（20个）、D簇表皮特异酯酶（2个）、E簇β酯酶（4个）和F簇非鳞翅目保幼激素酯酶（2个）。氨基酸序列分析结果显示,中华稻蝗大部分Ces的等电点（pI）均为偏酸性或弱酸性,pI为4.38-6.84,只有3个Ces的pI值偏碱性。中华稻蝗所有的Ces基因都具有N糖基化位点、N端保守的半胱氨酸残基及氧离子洞,信号肽预测结果表明19个Ces具有完整的信号肽;21个Ces具有典型的催化三联体S-E-H,其余7个Ces催化三联体发生了不同的替换。GeNorm与Normfinder分析结果显示,4个候选内参基因稳定性EF1α=RP49＞β-actin＞GAPDH。选择EF1α作为内参基因,RT-qPCR结果显示10个羧酸酯酶基因在7个不同组织部位均有表达,其中OcCesA1、OcCesA6、OcCesA12、OcCesA14、OcCesA18和OcCesA19在中肠和胃盲囊高表达,此外OcCesA6、OcCesA18和OcCesA19还在马氏管高表达,OcCesA2在后肠高表达。OcCesD1在马氏管表达量最高,脂肪体和表皮次之;OcCesE1在胃盲囊表达量最高;OcCesF2在中肠表达量最高。【结论】基于中华稻蝗转录组数据库获得28个全长Ces基因,聚类分析结果显示,这些基因分布于4个功能簇中,其中分布于A簇的基因数目相对较多,且多在中肠、胃盲囊和马氏管等代谢解毒器官中高表达。研究结果为Ces基因功能的深入探索和中华稻蝗Ces基因分子靶标研发提供了依据。 相似文献
7.
东亚飞蝗几丁质酶家族基因的表达特性与功能研究 总被引：3，自引：6，他引：3
【目的】研究东亚飞蝗几丁质酶家族基因的时空表达特性及其在蜕皮发育中的生物学功能,筛选在飞蝗发育过程中致死性的几丁质酶基因,为实现基于RNAi的飞蝗有效控制提供重要的基础数据。【方法】在东亚飞蝗EST数据库搜索几丁质酶基因片段,用生物信息学方法分析所获得的基因片段序列;以飞蝗不同龄期第4天若虫和5龄东亚飞蝗不同组织部位为材料提取RNA并反转录为cDNA,应用RT-PCR方法研究时空表达特性;选取在表皮高表达的几丁质酶基因LmCht6,采用RNA干扰方法研究其生物学功能。【结果】基于东亚飞蝗EST库搜索和进一步的序列分析,共获得7条几丁质酶基因片段;不同组织部位与不同龄期RT-PCR结果表明这7条几丁质酶基因的时空表达特性存在明显差异,其中LmCht6主要在表皮表达;LmCht6的RNA干扰试验表明：2龄飞蝗注射dsLmCht6后,其几丁质酶基因LmCht6表达量明显降低;飞蝗从2龄到3龄的龄期转化过程中,表现为发育延迟,新表皮与旧表皮无法完全分离,导致死亡率达到72.2%。【结论】东亚飞蝗拥有多个几丁质酶基因,它们的时空表达特性存在差异;LmCht6在飞蝗蜕皮过程中具有十分重要的生物学功能,该基因被沉默后飞蝗无法完成蜕皮而导致死亡。 相似文献
8.
【目的】获得中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质酶基因10（OcCht10）的cDNA序列,预测其功能域,并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱,研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能,为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10 cDNA片段,经过blast分析、比对、拼接后,翻译为氨基酸序列,预测其功能域,并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析,进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名;选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本,总RNA提取后反转录为cDNA模板,采用Real-time quantitative PCR（qPCR）方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱;设计OcCht10 dsRNA引物,用试剂盒体外合成dsOcCht10,采用注射法进行RNA干扰;取注射24 h稻蝗表皮样本,用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率;并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型,统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索,获得OcCht10 cDNA片段长度为9 318 bp,开放阅读框为8 613 bp,编码2 870个氨基酸;其3′非编码区为705 bp,推测OcCht10 5'端有500多碱基尚未获得;预测其氨基酸序列具有多个结构域,包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域;与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因Ⅱ组,该组基因与昆虫蜕皮相关;5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达,提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢;发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6-7天,即蜕皮前的表皮中高表达,表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解;5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA,24 h后取表皮检测其干扰效率,结果显示该基因被沉默70%;与注射dsGFP的对照组相比,注射dsOcCht10 5龄若虫表现为龄期延长,旧表皮无法开裂,蜕皮受阻,昆虫无法正常活动导致死亡,死亡率达到100%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列,该基因在昆虫蜕皮前表皮中高表达;OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育,注射dsOcCht10可有效沉默靶基因,并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。 相似文献
9.
飞蝗几丁质合成酶2基因的表达特性、功能及调控 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】几丁质合成酶（chitin synthase,CHS）是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一,由于高等动物不存在该酶,而被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。论文在已克隆得到飞蝗几丁质合成酶2基因cDNA序列（LmCHS2,GenBank登录号：GU067731）的基础上,进一步深入探讨该基因在不同发育时期的表达特性、功能及调控,为基于RNA干扰技术的飞蝗有效控制提供科学依据。【方法】根据已知LmCHS2 基因核苷酸序列,设计特异性表达引物,运用RT-qPCR技术研究该基因在卵、若虫及成虫期的表达特性;体外合成LmCHS2的dsRNA后,分别注射至成虫期第1天的雌虫和雄虫,收集第5天的中肠样本提取RNA,反转录成cDNA后,采用RT-qPCR方法检测LmCHS2沉默效果。解剖飞蝗整个肠道后,观察中肠的形态变化及围食膜的完整性,探讨该基因在成虫期的生物学功能;饥饿处理飞蝗不同时间后,再重新进食,观察试虫肠道的变化,进一步运用RT-qPCR技术检测LmCHS2的表达。【结果】LmCHS2在飞蝗卵发育的前期和中期几乎没有可检测到的表达,卵发育后期表达量急剧上升,在4龄、5龄若虫和成虫期稳定表达;分别对羽化后第1天的雌、雄成虫注射dsCHS2,与对照组相比,处理组试虫LmCHS2表达量均显著下降,且取食量明显减少,雌虫和雄虫死亡率分别达78%和85%;解剖消化道后发现,注射dsCHS2后飞蝗中肠几乎不含有食物,中肠和胃盲囊长度显著缩短;对中肠的组织学观察结果表明对照组飞蝗围食膜发育完整,而注射dsCHS2后围食膜被严重破坏甚至缺失;饥饿处理飞蝗48 h后,与对照组相比,饥饿组中肠几乎不含有食物,长度亦显著缩短。H&E染色结果表明,饥饿组围食膜被严重破坏,对照组围食膜结构完整,与RNAi的结果非常相似;重新进食后围食膜发育良好;饥饿处理24 h和48 h后LmCHS2的表达被显著抑制,重新进食0.5 h后,其表达量快速上调,表明进食影响LmCHS2的表达。【结论】LmCHS2参与中肠围食膜的形成,对飞蝗的生长发育至关重要,该基因的沉默影响中肠围食膜的完整性,使飞蝗对食物的消化吸收困难,最终因饥饿而死亡;此外,该基因的表达受飞蝗进食的调控。 相似文献
13.
印楝素不同处理方法对烟粉虱的室内毒力测定 总被引：7，自引：0，他引：7
【目的】明确印楝素及其不同施药方式对烟粉虱各虫态的致死作用。【方法】采用黄瓜叶片浸液法和叶柄内吸法测定了0.3%印楝素乳油对烟粉虱成虫、1日龄卵、5日龄卵和1～4龄若虫的室内毒力。【结果】在所测试的浓度范围（0.3125～10.0 mg•L-1）内,两种处理方式下烟粉虱各虫态的校正死亡率均随印楝素浓度的增大而顺次显著增大,印楝素叶片浸液处理的校正死亡率高于叶柄内吸处理。印楝素叶片浸液处理对烟粉虱成虫、1日龄卵、5日龄卵、1龄若虫、2龄若虫、3龄若虫、4龄若虫的致死中浓度LC50值分别为3.0246、2.2019、5.7109、0.5909、0.7465、1.6948和2.6603 mg•L-1,而叶柄内吸处理的LC50值分别为6.016、4.0321、6.0537、0.8614、0.9941、2.2419和4.4533 mg•L-1。【结论】印楝素叶片浸液处理对烟粉虱各龄若虫的致死作用均高于叶柄内吸处理,烟粉虱低龄若虫期是采用印楝素防治的最佳时期。印楝素乳油可望成为防治烟粉虱的重要药剂之一。 相似文献
14.
螺虫乙酯对桃蚜的毒力及持效期 总被引：3，自引：0，他引：3
[目的]明确新型内吸型杀虫剂螺虫乙酯对桃蚜(Myzus persicae)的毒力及持效期.[方法]利用3种生物测定方法开展螺虫乙酯对桃蚜的室内生物测定,用定量数据概率和时间剂量死亡率模型分析螺虫乙酯对桃蚜的毒力,并利用微虫笼法对螺虫乙酯的持效期进行研究.[结果]玻璃板法、微虫笼法和圆片法的测定结果存在差异,微虫笼法进行生物测定时植物叶片的保持时间较长,测定结果更加可靠.3种生物测定方法测得的桃蚜若蚜死亡率随着时间的延长呈上升趋势,到120 h达稳定.利用定量数据概率的方法分析表明,玻璃板法、微虫笼法和圆片法测定的螺虫乙酯对桃蚜若蚜的LC50分别为0.0886、0.1258和0.8459 mg·kg-1,利用时间剂量死亡率模型分析表明,在1.5625 mg·kg-1下的LT50分别为2.5、2.9和3.5d,LT50随着药剂浓度的增大而递减.螺虫乙酯具有较长的持效期,防治效果在施药7d后开始下降,死亡率由100％降低至20％以下.[结论]本研究提出的用微虫笼进行螺虫乙酯生物测定的方法,可为长持效期药剂的生物测定提供参考;目前田间桃蚜种群对螺虫乙酯仍处于非常敏感的状态. 相似文献
15.
【目的】将飞蝗（Locusta migratoria）谷胱甘肽硫转移酶sigma2（glutathione-S-transferases sigma2,LmGSTS2）在大肠杆菌中原核表达后进行纯化,研究LmGSTS2的酶学特性,并分析其对马拉硫磷和p,p’-DDT的代谢作用。结合飞蝗体内LmGSTs2的RNA干扰及杀虫剂生物学测定,评估LmGSTS2对杀虫剂的代谢解毒能力,为飞蝗抗性治理及合理施药提供理论依据。【方法】将LmGSTS2在BL21(DE3)中表达,通过Ni-NTA亲和层析对LmGSTS2进行纯化,以CDNB为底物检测LmGSTS2在不同温度和pH条件下的酶活性变化。在最适条件下（pH=7,27℃）,用纯化的LmGSTS2蛋白与马拉硫磷和p,p’-DDT进行孵育,通过超高效液相色谱（UPLC）评估LmGSTS2对马拉硫磷和p,p’-DDT的代谢解毒能力。进一步将3 μg dsLmGSTs2注入2龄飞蝗若虫体内,24 h后检测目的基因LmGSTs2的沉默效率,并结合杀虫剂生测试验分析飞蝗对杀虫剂敏感度的变化。【结果】将LmGSTS2在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE检测后,发现与两个对照组pET28a/BL21(DE3)和未诱导的pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2相比,诱导后的pET28a/BL21(DE3)-LmGSTS2总蛋白在25 kD左右出现与目标蛋白大小相符的单一条带,表明LmGSTS2成功表达。对纯化后LmGSTS2蛋白的酶学特性研究结果表明,其最适反应pH范围为6—8,在pH=7时酶活性达到顶峰;最适反应温度范围为25—30℃,27℃时活性最高。在最适条件下,LmGSTS2分别与马拉硫磷和p,p’-DDT进行孵育。UPLC结果显示,与3个对照组相比（GSH+insecticide、active LmGSTS2+insecticide及inactive LmGSTS2+GSH+ insecticide）,LmGSTS2组马拉硫磷色谱峰面积分别降低83.6%、84.0%和84.6%,差异显著（P<0.05）,而p,p’-DDT色谱峰面积与对照组相比无显著变化（P>0.05）,说明LmGSTS2可对马拉硫磷进行代谢,对p,p’-DDT无代谢作用。进一步通过RNA干扰结合杀虫剂生测在飞蝗体内检测LmGSTS2蛋白对马拉硫磷的代谢解毒作用。将靶标基因的双链RNA注入2龄飞蝗若虫体内,24 h后可使飞蝗体内LmGSTs2表达量抑制96%。飞蝗对马拉硫磷的敏感度检测发现,与对照组相比,LmGSTs2基因沉默后飞蝗对马拉硫磷的敏感度增加,死亡率由29.9%上升至45.2%,表明LmGSTS2参与了马拉硫磷在体内的代谢解毒过程。【结论】将LmGSTS2在体外进行表达纯化,并以CDNB为底物检测到该酶最适反应条件为pH=7,27℃左右;对马拉硫磷的体内和体外检测结果显示,LmGSTS2参与马拉硫磷在飞蝗体内的代谢解毒过程;对p,p’-DDT的体外研究结果显示该酶不参与p,p’-DDT的代谢。 相似文献
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杀虫剂对褐飞虱捕食性天敌黑肩绿盲蝽的安全性评价 总被引：7，自引：0，他引：7
【目的】评估7类14种杀虫剂对褐飞虱Nilaparvata lugens（Stål）的重要捕食性天敌黑肩绿盲蝽Cyrtohinus lividipennis (Reuter)成虫、若虫和卵的安全性。【方法】在室内条件下,用药膜法、稻株喷雾法及稻茎浸渍法测定杀虫剂对黑肩绿盲蝽的安全性。【结果】药膜法测定结果表明氟虫腈、噻虫嗪和异丙威3种杀虫剂对成虫不安全（Ⅳ级）,LC50值为0.20～0.74 mg a.i.•L-1;氟硅菊酯、醚菊酯对成虫安全（Ⅰ级）,LC50值＞160.0 mg a.i.•L-1。稻株喷雾法测定结果表明噻嗪酮在药后1d对成虫安全（Ⅰ级）,死亡率为1.7％;在药后4～10 d,丁硫克百威、氟虫腈、噻虫嗪、吡虫啉为较不安全或不安全（Ⅲ级或Ⅳ级）,死亡率为70.0%～100.0%。稻茎浸渍法测定结果表明除噻嗪酮和阿维菌素外,其余供试杀虫剂均对黑肩绿盲蝽若虫不安全（Ⅳ级）。稻株喷雾法测定结果表明醚菊酯、阿维菌素、氟硅菊酯、敌敌畏、噻嗪酮对卵安全（Ⅰ级）,孵化抑制率＜20%,而丁硫克百威对卵较不安全（Ⅲ级）,孵化抑制率为52.24%。【结论】IGR类噻嗪酮对黑肩绿盲蝽各虫态均很安全,其它供试杀虫剂对黑肩绿盲蝽的安全性因杀虫剂和虫态的不同而异。 相似文献
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【目的】明确灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,SK)的分子特征,研究SK在携带水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)与健康灰飞虱两个种群的时空表达及其对杀虫剂胁迫的响应。【方法】利用PCR技术克隆灰飞虱SK(LsSK)基因序列;使用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析LsSK在带毒种群与健康种群灰飞虱1—5龄若虫及成虫期的表达差异,并检测该基因在雌雄虫头、唾液腺、中肠、马氏管、卵巢和精巢等组织中相对表达量;采用手动微量点滴仪将3种杀虫剂(吡虫啉、噻嗪酮和溴氰菊酯)点滴于灰飞虱4龄若虫中胸背板,确定3种杀虫剂的半致死浓度(LC_50);根据半致死浓度的3种杀虫剂处理试虫后检测LsSK的表达动态;采用注射双链RNA(dsRNA)的方法沉默带毒种群和健康种群4龄若虫体内LsSK后,用半致死浓度的3种杀虫剂处理试虫并分析死亡率。【结果】克隆得到一段长度为1 282 bp的LsSK基因片段(Gen Bank登录号:KT989975)。氨基酸系统进化树显示LsSK与其他半翅目昆虫SK聚在同一支。LsSK氨基酸序列包含SK酶的4个保守区域C1—C4,其中SK激酶的活性位点——DAG活性区域位于C1—C3区域。q RT-PCR结果显示LsSK在带毒种群4龄若虫中表达量最高,3龄次之;健康种群5龄若虫表达量最高,1、4龄次之。且LsSK在带毒种群3、4龄表达量显著高于健康种群同时期若虫(P0.05);带毒成虫LsSK表达量显著高于健康成虫(P0.05)。LsSK在带毒雄成虫各个组织中的表达量均显著高于同种群雌成虫和健康雌雄成虫的各相应组织,且在唾液腺和马氏管的表达量最高,头部次之。用半致死浓度的3种杀虫剂(吡虫啉LC_50为6.5 ng·μL~(-1),噻嗪酮为500 ng·μL~(-1),溴氰菊酯为37.5 ng·μL~(-1))处理带毒和健康种群的4龄若虫后,试虫LsSK含量变化与响应速度均不同。噻嗪酮处理后LsSK水平升高且响应最为迅速,溴氰菊酯处理后LsSK表达水平无变化(P0.05)。用3种杀虫剂处理带毒和健康试虫,其死亡率分析结果表明,两种群注射dsSK组3种杀虫剂处理后死亡率均显著高于两种群注射dsGFP组和不注射组。【结论】克隆了LsSK基因片段且其在带毒灰飞虱4龄若虫中表达量最高。沉默LsSK后,带毒和健康种群灰飞虱在杀虫剂处理后的死亡率均显著上升,表明SK基因有利于灰飞虱抵抗杀虫剂胁迫。 相似文献