含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780的构建     

邓丽  刘红  杨万年 《安徽农业科学》2008,36(26)

[目的]构建含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。[方法]用PCR方法扩增psmGFP的GFP片段,BamHI和SacI双酶切PCR产物,同时用BamHI和SacI双酶切pBI121。从琼脂糖凝胶中回收纯化pBI121的大片段,经连接、转化、鉴定出改造后的质粒。[结果]用PCR方法扩增得到长度为740 bp的增强型的绿色荧光蛋白基因片段,克隆入pBI121表达载体后,获得了新的重组质粒pBI121-GFP。分别将编码拟南芥BAG7、BAG4蛋白的基因At5g62390和At3g51780通过PCR方法扩增后,克隆入pBI121-GFP,构建了用于超量表达BAG蛋白基因的GFP融合蛋白双元表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。利用细胞感受态法将该植物表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101中。[结论]为进一步研究BAG蛋白在拟南芥抗性胁迫中的功能及其在细胞内的动态分布奠定了基础。  相似文献   

无花果ACS1基因RNAi植物表达载体构建     

唐霞  张帅  马俊莲  张子德 《河北农业大学学报》2013,(4):62-65

通过构建无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体,为研究ACS基因的功能及采用生物技术方法培育无花果耐贮新品种奠定基础。本试验根据已克隆的无花果ACS1基因序列及植物表达载体pBI221、pBI121的酶切位点,设计2对带相应酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,进行PCR扩增,获得正、反向扩增片段,分别正、反向插入到pBI221载体中的CaMV35S启动子和gusA基因之间,构建成无花果ACS1基因的RNAi中间表达载体。再将中间载体中的正、反向片段和gusA基因以双酶切方式连接到表达载体pBI121上,构建成pBI121-RNAi-ACS1植物表达载体。通过各种限制性内切酶的酶切鉴定,成功构建了无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体。  相似文献   

天麻抗真菌蛋白基因转化辣椒的研究   总被引：1，自引：0，他引：1  

张守鸿  李长福  葛正龙  范芳  冯雪松 《贵州农业科学》2010,38(5)

为获取辣椒的抗真菌种质资源,运用RT-PCR技术扩增出GAFP的cDNA序列,通过基因工程技术构建植物表达载体pBI121-GAFP,并导入遵椒1号辣椒。转化后再生的植株经PCR检测,初步证实GAFP基因已经整合到辣椒基因组中,得到了GAFP基因转化遵椒1号辣椒植株。  相似文献   

草莓乙烯受体Ers1基因反义植物表达载体构建     

唐霞  刘思思  马俊莲 《安徽农业科学》2012,(7):3899-3900

[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。  相似文献   

菜豆几丁质酶、烟草葡聚糖酶基因的分离克隆及双价表达载体的构建     

晏慧君  张婷  杨春梅  于丽霞  张宝琼  李涵 《云南农业大学学报(自然科学版)》2008,23(6)

几丁质酶基因(Chitinase,Chi)和葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase,Glu)具有协同抗真菌作用,根据GenBank号M13968,X53600分别设计引物,经RT-PCR扩增,克隆菜豆Chi基因和烟草Glu基因,将两个目的基因分别连上CaMV35S启动子和终止子Nos,然后串联在一起共同组建于一个表达载体pBI121中,重组表达质粒经过限制性酶切分析鉴定,结果表明含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功。为非洲菊、香石竹等花卉抗真菌基因工程育种奠定了基础。  相似文献   

鹅细小病毒NS1基因植物真核表达载体的构建     

李艳梅  张廷荣  吴春涛  沈涛  朱新产 《西北农业学报》2006,15(4):96-99

根据发表的鹅细小病毒GPV B株全基因组设计一对引物,采用PCR方法扩增出鹅细小病毒扬州株(GPV YZ)非结构蛋白基因NS1,克隆到植物表达载体pBI121中,转化至大肠杆菌感受态细胞JM109。经菌液PCR、双酶切及质粒PCR鉴定后,将阳性重组质粒转化感受态农杆菌LBA4404。经菌液PCR及质粒PCR分析,获得了真核表达载体pBI121-NS1,该载体的构建为进一步研究鹅细小病毒NS1基因的分子生物学特性打下良好基础。  相似文献   

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究     

孔华  郭安平  郭运玲  刘恩平  章霄云  贺立卡 《安徽农业科学》2006,34(24):6460-6462,6464

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。  相似文献   

pBI121表达载体及其转化植株的快速鉴定     

王华新  曹家树  向珣  余小林  叶纨芝 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2008,34(2):137-142

    以双元质粒pBI121为基础分别构建正义、反义和RNA干涉(RNAi)植物表达载体根据pBI121质粒多克隆位点两侧的DNA序列设计1对通用引物,以表达栽体的重组质粒DNA为模板进行PCR扩增,使用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切PCR产物以验证扩增条带的真实性,从而可以快速鉴定pBI121表达栽体的重组克隆这种方法也可用于快速鉴定上述表达载体的转基因植株,其检测结果与常规鉴定方法完全一致此外,可以根据需要对表达载体的阳性PCR扩增产物进行测序,测序结果能够精确地显示出重组pBI121表达栽体中目的片段的插入方向以及插入序列是否出现碱基突变本研究为各种pBI121表达载体及其转基因植株的鉴定提供了一种快速、有效的方法  相似文献   

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建   总被引：1，自引：0，他引：1  

于守江  王超 《东北农业大学学报》2008,39(7)

试验将从质粒pB110上克隆得到的Bt基因的片段,连接到高效的植物表达载体质粒pBI121上,此重组质粒经过限制性内切酶酶切分析和PCR鉴定,证明含有抗虫基因的植物表达重组质粒已构建成功。  相似文献   

植物afp表达载体的构建及其对农杆菌的直接转化     

尹明安  樊代明等 《西北农业大学学报》2001,29(2):1-5

详细报道了胡萝卜抗冻蛋白基因（afp)植物表达载体的构建过程及其直接法转化农杆菌的方法，以限制性内切酶从克隆载体上切取afp基因，将其连接在相应酶切的pBI121工程质粒上，构建成afp植物表达载体，采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌，并用PCR方法进行了鉴定。  相似文献   

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建   总被引：2，自引：3，他引：2  

梅眉  陆璐  赵长增  曾钰婷 《甘肃农业大学学报》2006,41(5):55-59

选育耐贮运品种是解决甜瓜贮运难题的有效途径之一.用特异引物从含甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)cDNA全序列的pCMPG质粒中克隆出PG基因,将该基因连接至pGEM-T Easy载体,获得重组质粒pGEM-PG.先用SacI和XbaI双酶切pGEM-PG,再用SacI和XbaI消化pBI121,得到除去了GUS基因的线状载体.从pGEM-PG质粒上切下的PG1 cDNA片段的粘性末端和pBI121线状载体的粘性末端恰好反向匹配,构建了甜瓜PG1 cDNA反义序列植物表达载体.  相似文献   

甜瓜蔗糖合成酶基因(CmSS1)反义表达载体的构建及遗传转化     

闻小霞  赵荷仙  刘刚  周爱凤  张桂梅 《山东农业科学》2013,45(4)

以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD18-T-CmSS1和表达载体pBI121,再用T4 DNA连接酶将回收的目的片段反向与pBI121连接。结果证明,CmSS1反向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmSS1的重组质粒;利用农杆菌介导法将反义CmSS1基因转化甜瓜,经PCR检测,得到5株转基因植株。这为以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性调节机制及通过基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基础。  相似文献   

牡丹ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建     

施江  高双成  孔祥生  刘素云  郭永新  陈春燕  郁飞燕 《河南农业科学》2009,(1)

利用CTAB改良法提取牡丹洛阳红花瓣总RNA,通过反转录酶和设计的ACC氧化酶基因特异引物合成709bp目的片段,进行测序和比对,以确定目的片段的正确性。在709bpACC氧化酶基因片段和pBI121植物表达载体上选择合适的酶切位点,进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切。将709bp片段上切下的510bp片段反向插入pBI121植物表达载体35S启动子后面,构建成含510bp牡丹ACC氧化酶基因反义表达载体。最后采用电击法转化进感受态农杆菌GV3101,以备用于花粉管通道法转化牡丹。  相似文献   

猪传染性胃肠炎病毒S基因植物表达载体的构建     

王龙涛  葛晨霞  高雯雯  付永平  王丕武  胡桂学 《吉林农业大学学报》2010,32(6):670-674

应用RT-PCR技术克隆了猪传染性胃肠炎病毒TGEV-JL株S基因全序列,将其连接到pMD18-T载体。经SacⅠ和BamHⅠ酶切鉴定,其产物全长4320bp。测序后与TH-98等8个TGEV毒株的S基因序列进行比对,同源性为97.6%～99.8%。将该基因插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游,构建高效植物表达载体,转入根癌农杆菌EHA101中。结果表明:成功构建了重组植物表达载体pBI121-S,获得农杆菌工程菌。  相似文献   

水蛭素基因植物表达载体的构建     

张正奇  荣水连  胡华  李新梅 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2007,34(3)

在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下,根椐植物基因密码子选择偏向,对水蛭素基因序列进行了改造．在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、poly(A)尾、XbaⅠ和SacⅠ双酶切位点．将所合成序列与双元载体pBI121重组,构建成pBI121-hir植物高效表达载体．经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3种方法鉴定,该载体构建成功．  相似文献   

蚯蚓纤溶酶基因番茄表达载体的构建     

米国桥  李继刚  贾永亮 《河北农业大学学报》2008,31(6)

为研究蚯蚓纤溶酶的番茄表达,构建EFE基因的番茄表达载体pF和pEF,并导入农杆菌。采用PCR法在EFE基因DNA序列上添加了表达调控元件和酶切位点后,得到新EFE基因片段,将该片段与切去GUS基因的pBI121载体相连,以构建CaMV35S驱动的EFE组成型表达载体pF;用PCR克隆得到的E8启动子片段替换pF上的35S启动子,以构建番茄成熟果实特异性表达载体pEF;最后,采用三亲交配法用重组质粒转化根癌农杆菌EHA105;结果表明:经过酶切、PCR和测序鉴定,EFE基因、E8启动子序列已重组到表达载体上,植物表达载体构建正确,并且已经转化进农杆菌EHA105中。  相似文献   

PBI121/GPAT质粒的构建及对非洲菊转化^*     

尹梅  程在全  夏小环  陈志伟  陈善娜 《云南农业大学学报(自然科学版)》2009,24(5):717-721

 为提高植物抗寒性,本文构建一个植物表达载体,并对非洲菊进行转化。用已克隆的强抗冷植物兵豆的甘油-3-磷酸转酰酶（GPAT）基因构建表达载体,将GPAT插入表达载体pBI121质粒取代该质粒上原有的GUS基因,并用PCR和酶切进行鉴定。用农杆菌介导的方法将该质粒转化到非洲菊中。结果表明该植物表达载体构建成功,同时对非洲菊高效转化体系进行探索,获得卡那霉素抗性苗7苗。  相似文献   

甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建   总被引：1，自引：0，他引：1  

马乐园  于喜艳 《山东农业科学》2011,(8):4-7

根据C,enBank中登记的甜瓜八氢番茄红素合成酶（CmPSY）基因序列设计引物,利用lit—PCR技术克隆了甜瓜PSY全长基因,该基因全长1443bp,编码421个氨基酸,在GenBank中登记号为GU361622。以＆帆HI和剐I双酶切pMDI8-T—CmPSY和表达载体pBI121,再将回收的目的片段与pBI121用T4 DNA连接酶连接,结果证明,渊y正向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmPSY的重组质粒。该研究为了解甜瓜八氢番茄红素合成酶的活性调节机制,并通过基因工程手段研究甜瓜PSY的活性奠定了基础。  相似文献