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1.
几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase,CDA）能催化几丁质脱乙酰化产生壳聚糖,在几丁质降解过程中发挥着重要作用。本研究通过分析甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）转录组得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的全长CDS序列,命名为SeCDA8（GenBank登录号为OL689577）,其开放阅读框为1158 bp,编码385个氨基酸。NCBI Blast和系统进化分析表明其属于肠道特异CDA蛋白,与斜纹夜蛾CDA相似度最高。成功构建原核重组表达载体pET30a-SeCDA8,转化大肠杆菌,经超声破碎后在沉淀中表达45 kD的重组蛋白。重组SeCDA8蛋白的几丁质结合活性分析结果显示,SeCDA8蛋白与再生几丁质的结合活性较高于胶体几丁质,但均较弱。qRT-PCR分析显示,SeCDA8在前肠和中肠前部高表达,推测其可能与围食膜形成有关。通过探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA8蛋白的几丁质结合活性和组织定位,为更加深入地探究第Ⅴ类CDA的生理功能提供了重要的理论依据。 相似文献
2.
亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我国玉米最重要的害虫，了解亚洲玉米螟表皮形成的机制将有助于对其开展生物防治。表皮蛋白和几丁质是构成昆虫表皮的两种主要成分，因此研究两者的相互作用对于阐明昆虫表皮形成机制具有关键意义。CPR9是亚洲玉米螟体壁表皮转录组中相对丰度最高的表皮蛋白基因。序列分析发现CPR9属于CPR家族中RR-1亚家族的表皮蛋白，含有R&R结构域，可能是通过结合几丁质来发挥功能。为了研究CPR9与几丁质的相互作用，本研究利用pET-SUMO载体实现了SUMO-CPR9融合蛋白的可溶表达，并通过SUMO蛋白酶处理及两次金属螯合亲和层析纯化了CPR9，平均收率为5 mg/L。几丁质结合试验发现，CPR9对不同类型的几丁质的结合具有选择性。CPR9对α-几丁质结合能力很强，对胶体几丁质结合能力较强，但不与β-几丁质结合。脱乙酰几丁质（壳聚糖）结合试验发现，CPR9能与脱乙酰几丁质结合并使其发生团聚。圆二色光谱分析表明，CPR9在结合脱乙酰几丁质后，其二级结构中平行β折叠和β转角比例上升，反平行β折叠及无规卷曲比例下降。本研究发现了CPR家族表皮蛋白与不同类型几丁质的结合存在特异性，而且在结合过程中会发生结构变化，有助于进一步了解昆虫表皮的形成机制。 相似文献
3.
暗黑鳃金龟Holotrichia parallela是一种重要的农业害虫,其成虫和幼虫均能对多种作物造成严重危害。为筛选对暗黑鳃金龟成虫具有毒杀活性的Bt蛋白,本研究首先对暗黑鳃金龟成虫的生活习性进行观察,用浸泡蛋白的榆树叶饲喂成虫,建立了Bt蛋白对暗黑鳃金龟成虫的生物学活性测定方法;制备了6种Bt Cry8类杀虫晶体全长蛋白和胰蛋白酶消化蛋白,对暗黑鳃金龟成虫进行了杀虫活性测定。初筛结果发现Cry8Ga1原毒素和消化蛋白均对暗黑鳃金龟成虫具有较高毒杀活性,其在浓度1.0 mg/mL时对暗黑鳃金龟成虫的7 d校正死亡率分别为100%和55%。为更进一步确定Cry8Ga1蛋白的杀虫活性,进行了致死中浓度测定,7 d生测结果显示,Cry8Ga1原毒素的LC50为0.387 mg/mL （95%置信区间为0.108~0.746 mg/mL）,Cry8Ga1蛋白经胰蛋白酶消化后的LC50为0.702 mg/mL （95%置信区间为0.150~2.664 mg/mL）。取食Cry8Ga1原毒素蛋白及其消化蛋白后的暗黑鳃金龟成虫中肠细胞产生显著的病理学变化。本研究筛选到对暗黑鳃金龟成虫有毒杀作用的Bt蛋白,研究结果将为金龟子的生物防治开辟新的途径。 相似文献
4.
表皮蛋白是昆虫表皮的重要组成成份，在昆虫的生长发育过程中起着重要作用，有可能成为农业害虫的防治靶标。双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus是铁皮石斛的一种重要害虫，且对其表皮蛋白的研究较少。本文通过研究双叉犀金龟表皮蛋白Td14144的表达纯化及与几丁质结合的相关性质明确Td14144功能的重要性。根据双叉犀金龟转录组测序数据，利用RT-PCR获得表皮蛋白Td14144基因（GenBank登录号：MZ463195），并对其进行生物信息学分析。序列分析表明表皮蛋白Td14144属于CPR家族中RR-2亚族，含有R&R保守结构域；系统进化分析结果表明，Td14144与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的AgCP的亲缘关系最近。随后将基因片段与pET-28a载体同源重组构建表达载体pET28a-14144，在大肠杆菌Escherichia coli BL21中原核表达，并使用金属螯合层析进行分离纯化，SDS-PAGE及Western blot验证重组蛋白的表达纯化，成功获得95%以上纯度的Td14144蛋白。利用几丁质结合试验评估Td14144与不同类型几丁质结合的能力，发现Td14144可以与壳聚糖、α-几丁质、β-几丁质和胶体几丁质结合，其中对壳聚糖和α-几丁质的结合能力最强。 相似文献
5.
利用RACE-PCR方法,扩增得到编码美国白蛾Hyphantria cunea Drury几丁质脱乙酰酶基因HcCDA1.将该基因分别在大肠杆菌BL21和毕赤酵母细胞Pichia pastoris GS 115表达.经诱导表达后,Western blot分析表明HcCDA1在大肠杆菌中成功表达61.8 kD的蛋白,符合预期大小;在毕赤酵母GS115中成功表达80 kD蛋白.酶活性试验显示酵母细胞中表达的重组蛋白酶活力为1.685 U/mL.本研究利用毕赤酵母成功表达具有酶活力的重组HcCDA1蛋白,为进一步明确该蛋白的生理功能提供条件. 相似文献
6.
海藻糖是昆虫的血糖,为昆虫提供能量;海藻糖酶催化海藻糖分解为葡萄糖,是几丁质生物合成的原料。围食膜（peritrophic membranes,PMs）是昆虫消化道特有结构,对昆虫消化食物、保护肠道表皮细胞具有重要作用;几丁质是PMs的重要组分。海藻糖酶（trehalase,Tre）和几丁质合成酶（chitin synthase,CHS）是几丁质合成途径的第1个和最后1个酶。本研究通过饲喂亚洲玉米螟（Orstrinia furnacalis,Asian corn borer,ACB）膜结合海藻糖酶（OfMT）基因特异的干扰dsRNA,研究RNAi对ACB幼虫中肠CHSB（OfCHSB）基因表达及幼虫发育的影响。发现处理48 h后,OfMT基因和OfCHSB基因表达量分别下降了52%和53%,幼虫发育迟缓。通过对处理及对照ACB幼虫中肠石蜡切片进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-ethanol,HE染色）和几丁质标记,发现血腔内脂肪体组织减小、中肠围食膜组织中几丁质含量减少。推测OfMT基因有可能成为ACB的生物防治的靶标基因。 相似文献
7.
哈茨木霉Trichoderma harzianum Th-33的Ⅲ型Gα亚基Thga3可能参与调控木霉菌的生长、产孢、几丁质酶活性、疏水性等生物学过程。为进一步明确其功能,本研究采用Hiseq2500（Illumina）测序平台,对野生菌Th-33和thga3基因敲除突变株△thga3进行转录组测序,分析其G蛋白信号系统、细胞壁降解酶类和产孢相关基因的差异表达。与野生菌相比,△thga3有3个G蛋白偶联受体基因发生下调表达,3个几丁质酶基因以及产孢调控基因brlA下调表达,1个G蛋白信号调控蛋白RGS1上调表达。推测thga3可能通过调控brlA的表达正调控产孢;通过调控疏水蛋白基因Tha_09745的表达调控菌丝疏水性。此外,通过调控几丁质酶基因的表达、G蛋白信号网络中其他蛋白的表达,影响菌株的拮抗和重寄生能力以及其他生物学特性。本研究为进一步探索G蛋白信号途径调控木霉菌生防特性及其机制奠定了基础。 相似文献
8.
几丁质酶是几丁质水解的关键酶,在昆虫生长发育中具有重要作用。本试验通过高通量转录组测序获得黏虫几丁质酶基因cDNA序列MsCHT7（GenBank登录号MG551526）。cDNA全长3360 bp,包含一个长度为2970 bp的开放阅读框,编码989个氨基酸,具有1个糖苷水解酶18家族高度保守序列,2个Glyco_18催化结构域和1个几丁质结合结构域ChtBD2。通过基因表达水平研究发现,黏虫MsCHT7基因在不同发育阶段和不同组织中均有表达,且具有差异性。预蛹期和表皮MsCHT7基因表达量最大,蛹期最后1 d和成虫表达量较高,且幼虫各龄期最后1 d表达量均高于第1 d表达量。20E（20-羟基蜕皮酮）处理幼虫后,不同时间点MsCHT7基因表达量存在显著差异,在1～24 h基因表达量随时间逐渐升高,24 h时最高,之后表达量迅速降低。4种不同浓度20E处理后,MsCHT7基因表达量存在一定差异,当浓度为10 μg/μL时,MsCHT7基因表达量最大。通过生物学观察发现,不同浓度20E处理后5龄幼虫蜕皮时间均提前。由于MsCHT7基因表达量受蜕皮激素调控,MsCHT7可能在黏虫蜕皮过程中发挥一定作用。 相似文献
9.
几丁质脱乙酰基酶是几丁质修饰关键酶,在昆虫几丁质组装过程中发挥重要作用,是潜在的绿色农药靶标。课题组近期研究发现家蚕中肠3个几丁质脱乙酰基酶中,BmCDA7对围食膜几丁质具有最高活性,在进食期高表达,可能参与该时期围食膜形成。本研究通过进一步优化分离纯化条件,建立了金属螯合层析和阴离子交换层析两步分离纯化方法,获得了高纯度的BmCDA7重组蛋白。采用SDS-PAGE结合Calcofluor White M2R显色定性确定了BmCDA7对底物乙二醇几丁质的催化活性。通过测定催化反应过程中释放的乙酸量,确定了BmCDA7的最适反应条件、稳定性及底物选择性。BmCDA7催化反应最适温度为60℃,最适pH为8.0,在温度低于60℃以及中性、偏碱性条件下较为稳定。此外,BmCDA7对乙二醇几丁质、胶体几丁质的酶活力分别为2.9926和0.4270 μmol/（min·μmol）,而对高结晶度的α-几丁质和β-几丁质无活力。这些结果丰富了昆虫几丁质脱乙酰基酶的生物化学基础研究。 相似文献
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表达的hrmA蛋白质具有诱导水稻细胞产生防卫反应的活性 总被引：2，自引：0，他引：2
将丁香假单胞菌hrmA基因构建到原核表达载体pET 29中,得到重组载体pET hrmA。将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,获得了以包含体形式存在的融合蛋白。复性的融合蛋白能诱导水稻悬浮细胞的活性氧迸发,处理20min后达到峰值。Northern杂交结果表明hrmA蛋白能显著地诱导PBZ1基因在水稻悬浮细胞中表达,在所观察的时间内PBZ1基因表达丰度随处理时间延长而增加,用hrmA处理水稻植株,诱导了PAL基因的表达。实验结果表明hrmA融合蛋白具有激活水稻细胞防卫反应的活性。 相似文献
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The NS2 gene of Rice stripe virus (RSV) was amplified by RT-PCR, cloned into pGEM-T vector and sequenced. The NS2 gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a to produce recombinant plasmid pET32a-NS2. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) pLysS. SDS-PAGE and Western blot analysis confirmed that NS2 fusion protein was expressed after induction by IPTG. The recombinant NS2 protein was purified with Ni2+-NTA agarose affinity chromatography and the polyclonal antibody against NS2 protein was raised in rabbit. NS2 protein was successfully detected in small brown planthopper (Laodelphax striatellus) at 1:1 600 dilution of the total protein of single planthopper and in infected rice (Oryza sativa) at 1:800 dilution of 10 mg leave by dot immunobinding assay using the polyclonal antibody. 相似文献
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Based on the sequence of jasmine virus H, the specific primer pairs were designed to amplify the cDNA of coat protein (CP) by PCR using plasmid from previous study as template. The PCR fragment was then cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a (+). Subsequently, the recombinant plasmid pET-JaCP was transformed into Escherichia coli JM109. The positive clones were then screened and sequenced. The resulting recombinant plasmid was prepared and transformed into E. coli Rosetta (DE3), which designed to enhance the expression of exogenous proteins. The CP fused with His-tag was over-expressed with IPTG induction and purified using Ni2+-NTA Agarose affinity chromatography. New Zealand white rabbits were immunized with the purified protein for specific antibody. The ELISA result of JaVH infected Nicotiana benthamiana indicated that the 1 000 times dilution of prepared antiserum is best for sample detection in the three tested dilution. Western blot analysis showed that 1 000 times diluted antiserum could be used to specifically detect jasmine samples carrying JaVH. 相似文献
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通过PCR和反向PCR,从蜡样芽孢杆菌M22中扩增到2条长度为1 322 bp和1 395 bp的基因片段(GenBank登录号为AY540749和AY468485),分别含657 bp和627 bp的开放阅读框,各自编码218个和208个氨基酸残基的功能蛋白。2个蛋白氨基酸序列同源性为46%,均不含信号肽。与其它锰超氧化物歧化酶序列同源性高,保守氨基酸残基类型及位置与其它Mn-SOD相同,可确定2个基因均为蜡样芽孢杆菌Mn-SOD基因。分别将2个基因的开放阅读框插入载体pET-22b (+)构建表达质粒pET-sodA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量分别为28 kD和27 kD。转入pET-sodA的SOD缺陷型大肠杆菌QC779转化子恢复在10μmol/L paraquat的LB平板上生长的能力。活性电泳显示,M22的Mn-SOD在QC779中成功表达。 相似文献
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鉴定昆虫嗅觉相关蛋白基因并对其序列和时空表达进行研究,可为阐明昆虫与寄主间的化学通讯机制提供依据.本文新克隆并鉴定获得一个西花蓟马OBP基因FoccOBP3(GenBank登录号:MT682352),cDNA序列全长1226bp,读码框全长432bp,编码143个氨基酸残基.氨基酸序列中六个保守的半胱氨酸位点排列方式为... 相似文献