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GFP基因在苜蓿转化组织中的荧光表达量分析 总被引：1，自引：1，他引：0
利用农杆菌介导法将溶菌酶(Lyz)与绿色荧光蛋白(GFP)基因转入"甘农3号"紫花苜蓿(Medicago sativa)中,获得含有双元基因的紫花苜蓿转基因植株。在荧光显微镜下对不同处理、不同培养时期的苜蓿转化愈伤组织及再生转化植株进行荧光检测和荧光表达量的对比分析。结果表明:经预培养的转化愈伤组织中的荧光表达量明显高于未经预培养的转化子;3 d为共培养的最佳时间;侵染时经过摇床上摇动的负压处理,荧光表达量高于静止状态;共培养3 d后的转化荧光表达量达最强,随培养时间延长,表达量少量减少,但能够稳定表达。 相似文献
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紫花苜蓿(Medicago sativa L.)愈伤组织再生率受基因型限制,是影响苜蓿遗传转化效率的主要因素之一。研究发现,GRF转录因子家族基因在提高多种植物愈伤再生中起着重要促进作用。本试验以拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGRF序列为模板,在紫花苜蓿基因组序列中查找,获得了含有miR396靶点的9个MsGRFs基因。除MsGRF3a和MsGRF4a外,其余7个MsGRFs在紫花苜蓿胚性愈伤组织中的表达量均显著高于非胚性愈伤。为了进一步研究MsGRFs对紫花苜蓿愈伤再生效率的影响,我们在紫花苜蓿中转入MIM396基因,降低miR396的表达。结果显示：MIM396植株叶片愈伤组织再生时间显著缩短,再生率显著提高;与野生型愈伤组织相比,在MIM396植株叶片诱导的愈伤组织中,除MsGRF3a外,其余MsGRFs显著高表达。以上研究表明,miR396-MsGRF通路对苜蓿愈伤组织再生起着重要调控作用,这为提高苜蓿再生效率,并打破基因型对不同苜蓿品种再生的限制提供候选基因。 相似文献
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抗冻蛋白基因AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报 总被引：1，自引：1，他引：0
以胡萝卜基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上,经XbalⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到PBI121工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻性奠定基础.结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因AFP,并构建成AFP植物表达载体.获得了具有卡那霉素抗性的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳Kan筛选浓度为60 mg/L.经PCR技术鉴定,AFP抗冻蛋白基因已整合到苜蓿基因组中. 相似文献
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以新疆大叶苜蓿（Medicago sativa ‘Xinjiang Daye’）叶片作为转化受体,利用农杆菌介导法将从梭梭（Haloxylon ammodendron）中获得的甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）转化紫花苜蓿,研究选择剂卡那霉素对愈伤组织分化的影响,并采用正交试验设计优化了影响紫花苜蓿转化的4个主要因子,建立了农杆菌介导的紫花苜蓿高效转化体系,获得了转基因植株。结果表明：卡那霉素在愈伤组织分化培养时的上限浓度以50 mg·L-1为宜;转化过程中当浸染时间为5 min,菌液浓度OD600为0.2,外植体预培养6 d,共培养后清洗外植体的头孢雷素（Cef）浓度为800 mg·L-1是最佳转化方案,抗性芽分化率达到65.5%;4个因子中菌液浓度对转化率影响最大,清洗外植体的Cef浓度和浸染时间影响次之,外植体预培养时间的影响最小。经PCR和RT-PCR检测,初步证明了BADH基因已经整合到紫花苜蓿中,转化率为16.0%。 相似文献
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二穗短柄草幼胚再生体系及农杆菌介导转化的初步研究 总被引：2，自引：1，他引：1
以二穗短柄草3个品系BDR018,BD21,BD21-3的幼胚为外植体,研究了幼胚大小对胚性愈伤组织诱导和再生的影响。采用携带gus和bar基因双元表达载体(pDM805)的根癌农杆菌菌株AGL1对BDR018品系的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。本实验探讨了影响幼胚愈伤组织诱导再生及遗传转化的几个因素。结果发现,幼胚大小介于0.5～1.0mm之间的愈伤组织诱导率最高。随愈伤组织年龄的增加,BDR018,BD21,BD21-3愈伤组织的再生率下降,白化率上升。愈伤组织年龄在5～8周范围内转化效率较高,平均转化效率为38.5%。真空处理5min和0.01%的SilwetL-77处理均可提高转化效率。对转化植株进行GUS基因化学组织检测和PCR鉴定,初步证明外源基因已整合再生植株基因组中。 相似文献
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紫花苜蓿基因转化的影响因素分析 总被引：9，自引：1，他引：8
通过农杆菌介导法对紫花苜蓿不同品种植株进行了抗旱基因转化的研究,得到了一套紫花苜蓿基因转化的优化体系。研究表明,100 mg/L的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长有着显著的抑制效应。250 mg/L头孢霉素能够有效地抑制农杆菌菌株LBA4404的生长。紫花苜蓿供试材料被切后直接用OD600值为0.3~0.5的农杆菌LBA4404菌液侵染10~15 min;培养材料共培养3 d后在愈伤组织诱导培养基MS 2 mg/L 2,4-D 0.5 mg/LKT 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 250 mg/L Cef上诱导出愈伤组织;在体细胞胚分化培养基MS 1.0 mg/L BA 0.3 mg/L NAA 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 50 mg/L Kan 250 mg/L Cef上促进体细胞胚的分化;分化出的体细胞胚在再生培养基上(同分化培养基,Kan为80 mg/L)进一步发育成抗性转化苗;转化的无根小苗在生根培养基1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.8%琼脂 100 mg/L卡那霉素上可生长出根系。 相似文献
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利用农杆菌介导法将溶菌酶(Lyz)与绿色荧光蛋白(GFP)基因转入"甘农1号"杂花苜蓿(Medicago sativa Martyn)和"甘农3号"紫花苜蓿(Medicagosativa L.)品种中,获得含有该双元基因的苜蓿转基因愈伤组织;采用荧光检测和PCR扩增技术,检测到溶菌酶Lyz和绿色荧光蛋白GFP基因在苜蓿愈伤细胞中的表达;研究该双元基因在苜蓿品种"甘农1号"和"甘农3号"中转化的若干影响因素,确定适宜的转化条件以期提高基因转化效率。结果表明:75 mg·L-1的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长具有显著抑制效应;300mg·L-1头孢霉素能够有效地抑制农杆菌LBA4404的生长;OD600值为0.4-0.5的农杆菌适宜的侵染时间是10min;经预培养3-4d的材料侵染后再共培养3d之后,在愈伤组织诱导培养基MS+2,4-D 2.0mg·L-1+KT0.5 mg·L-1+0.6%琼脂+2.5%蔗糖的培养基上诱导出抗性愈伤组织;"甘农1号"和"甘农3号"的抗性愈伤组织诱导率分别为35%和32%。 相似文献
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选用公农1号紫花苜蓿,以5～7d苗龄的无菌子叶为外植体,通过农杆菌介导法将含有甜菜碱醛脱氢酶（BADH）和酸性蛋白酶（pepB）双价基因的无选择标记表达载体导入苜蓿子叶中,并用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选,得到抗盐碱转化植株。碱性盐浓度48mmol／L宜于子叶愈伤诱导,有利于转化植株的获得。对转化植株进行PCR检测,初步证明目的基因序列已经整合到苜蓿基因组中。移栽成活的13棵碱性盐抗性植株经PCR检测有3棵植株呈阳性。 相似文献
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紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系的建立 总被引：13，自引：6，他引：7
以我国农艺性状优良的丰产紫花苜蓿Medicago sativa品种大叶苜蓿和甘肃省广为种植的优质紫花苜蓿品种陇东、陇中、甘农1号、甘农3号等的下胚轴、子叶、叶片和叶柄为外植体研究了不同培养基、激素配比以及脯氨酸、蔗糖和活性炭对紫花苜蓿胚性愈伤组织和体细胞胚诱导分化的影响,结果表明:最佳胚性愈伤诱导培养基为MS 2,4-D 5 mg/L KT 1 mg/L;最佳外植体为下胚轴。最佳体细胞胚诱导和分化培养基为SH;脯氨酸对体细胞胚的诱导分化无明显作用;在培养基中添加活性炭会降低体细胞胚诱导率;蔗糖浓度为20 g/L时体细胞胚诱导率最高。同时还建立了紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系,为根癌农杆菌介导AtNHX1基因对紫花苜蓿的遗传转化打下了坚实的基础。 相似文献
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以"甘农3号"紫花苜蓿为受体,利用农杆菌介导法导入双价基因OvBAN/bar,通过PCR检测和Southern杂交分析表明,4个转基因株系含有目的基因且均出现杂交条带,其中2个株系为单拷贝,1个株系为双拷贝,1个株系为三拷贝;对获得的4株转基因苜蓿进行qRT-PCR分析表明,具有三拷贝数的1个转基因株系OvBAN基因的表达量最高,其次为双拷贝数的2个转基因株系,并且这些株系的花青素还原酶活性及缩合单宁含量均显著高于野生型苜蓿。以过量表达OvBAN基因的3株转基因苜蓿为试验材料,进行抗蚜性和除草剂耐受性分析。结果表明,与野生型苜蓿相比,转OvBAN/bar基因苜蓿对苜蓿蚜都具有较好的抗性,蚜虫抑制率为78%~93%;用0.5%的市售草铵膦喷施各株系,10d后各转基因株系除个别叶片枯萎死亡,其他叶片及茎秆生长状况良好,而野生型苜蓿全部枯萎死亡,表明bar基因已整合到转基因苜蓿基因组中并稳定表达。综上所述,转OvBAN/bar基因紫花苜蓿表现出良好的抗虫性和除草剂耐受性。 相似文献
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作为生物技术领域的前沿,转基因技术已在多种植物上取得重大进展。紫花苜蓿（Medicago sativa）是公认的优质牧草,通过转基因技术改良其遗传性状,提高其产量、抗性、品质等重要农艺性状已成为研究热点。本研究围绕与生产实践密切相关的非生物胁迫、生物胁迫、除草剂抗性、品质改良和生物反应器5个方面,归纳总结了近期紫花苜蓿转基因研究进展,并根据转基因紫花苜蓿的生物安全性和研究中存在的问题,分别提出了针对性建议并为今后的研究指明了方向,以期为我国紫花苜蓿的转基因基础研究和应用开发提供有益信息。 相似文献
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为探究抗除草剂转基因紫花苜蓿（Medicago sativa）的高效杂交种选育技术。本试验以‘公农1号’作为父母本配置了1个对照组合,以转Bar基因的抗草铵膦除草剂转基因紫花苜蓿作为父本,以雄性不育系MS-GN-1A作为母本,配置了11个杂交组合。对后代植株的抗性进行Bar试纸条、PCR检测,对产量和品质性状进行评价和筛选,结果表明,试验中有7个杂交组合的后代表现优异。此试验以紫花苜蓿雄性不育系作为母本配置杂交种,使抗除草剂转基因紫花苜蓿的目标性状高效且稳定遗传,同时在此试验基础上筛选出了优良杂交后代,为良种繁育提供了一定的理论基础。 相似文献
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二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol reductase,DFR)是缩合单宁生物合成途径中的关键酶,在单宁的合成中起着重要的作用。根据同源克隆的原理,利用RACE技术,从“中苜一号”苜蓿中克隆得到DFR基因(MsDFR),并对其进行了序列分析及不同胁迫条件下的表达模式分析。结果表明,MsDFR基因cDNA全长1 402 bp,包括开放阅读框1 023 bp,编码340个氨基酸,在N端存在1个NADP结合位点“VTGASGFIGSWLVMRLMERGY”,中部存在1个底物特异性结合的氨基酸基序“TLNVTEDQKPLWDESCWSDVEFCRRV”。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在荚果中表达量较高,根中较弱;在NaCl和GA3诱导下,MsDFR基因表达受到抑制;在黑暗条件下,该基因被诱导表达。由此推测“中苜一号”苜蓿中可能存在不依赖于GA3信号的单宁合成途径。 相似文献
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为获得MsMYB2基因过量表达的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株,利用PCR技术在紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆出MYB2基因并命名为MsMYB2,MsMYB2基因编码区全长834 bp,编码1条长度为278个氨基酸的多肽链。通过DNA重组技术将其与pBI121连接,成功构建了植物表达载体pBI-MsMYB2。通过花序侵染法获得具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株,并通过PCR和RT-PCR对目的基因进行检测,结果证明目的基因已整合到拟南芥基因组中并且可以表达,成功获得了MsMYB2基因表达的拟南芥转基因植株。 相似文献
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本研究以冰草属植物中的4个品种——蒙古冰草新品系(A.mongolicum Keng)、航道冰草(A.cristatum cv.Fairway)、诺丹冰草(A.desertorum cv.Nordan)和一个种间杂种冰草——蒙农杂种冰草(A.cristatum×A.desertorum cv.Hycrest-Mengnong)为材料,分别以幼穗为外植体建立了冰草组织培养再生体系。在此基础上,以调控脯氨酸生物合成最后一步的关键酶的突变体基因P5CS为目标基因,bar基因为筛选标记基因,用基因枪法轰击幼穗诱导的愈伤组织,获得转基因植株。利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中分离得到了CBF4及其启动子,并对CBF4启动子进行了序列分析和初步的功能分析。 相似文献
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Yáñez Ruiz DR Moumen A Martín García AI Molina Alcaide E 《Journal of animal science》2004,82(7):2023-2032
Three experiments were conducted in Granadina goats and Segure?a wethers fed at maintenance level to evaluate the effect of including a mixture of barley and a new by-product derived from olive oil extraction (two-stage dried olive cake) on ruminal degradation and passage kinetics (Exp. 1), fermentation pattern and protozoa population (Exp. 2), and urinary purine derivatives excretion (Exp. 3). Polyethylene glycol was supplied to the animals to evaluate the effects of tannins contained in the by-product. The experimental diets were as follows: alfalfa hay and alfalfa hay plus a concentrate, formulated with two-stage dried olive cake, barley, and a mineral-vitamin mixture either with or without the addition of polyethylene glycol to the drinking water. The inclusion of two-stage dried olive cake in the diet resulted in an increase of condensed tannins. Ruminal VFA concentration in goats and wethers increased (P < 0.05) and ammonia N (NH3-N) concentration decreased (P < 0.05). The inclusion of two-stage dried olive cake decreased (P < 0.001) urinary allantoin excretion only in wethers. Ruminal degradation profiles and fractional passage rates were similar in goats and wethers. The polyethylene glycol supply increased (P < 0.001) DM and N degradation rates in both animal species but did not modify the fractional passage rate. Ruminal fermentation patterns were also similar in goats and wethers and were affected by polyethylene glycol supply. In general, Entodiniomorphida and Holotricha protozoa counts were higher (P < 0.05) in the rumen of goats than of wethers. Protozoa count in wethers responded more to polyethylene glycol supply than in goats. The present work presents the first data obtained from a comparative study with sheep and goats concerning urinary excretion of purine derivatives. The excretion was similar in both animal species when fed alfalfa hay; however, polyethylene glycol affected only urinary allantoin excretion in wethers. Results suggest a greater sensitivity of wethers than of goats to two-stage olive cake condensed tannins. 相似文献
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以甘肃红豆草为材料,采用RT-PCR法克隆无色花青素还原酶LAR基因,分析该功能基因在甘肃红豆草不同器官表达的差异性。结果表明,克隆的甘肃红豆草LAR基因,与GenBank已报道LAR基因(登录号:HM152981)序列相似性达到98.34%,其ORF长为1089 bp,编码362个氨基酸残基;其编码的氨基酸序列与不同属豆科物种的相似性存在较大的差异。基因序列已注册到GenBank,序列登录号为KP013623。LAR基因在甘肃红豆草不同器官表达差异较大;其中叶中表达量最高,其次是花和果,茎中表达量最低,这与器官间缩合单宁含量的变化规律一致。推测其表达与甘肃红豆草缩合单宁器官间的积累差异有关。这些研究结果也为探索缩合单宁积累和表达调控的机制提供基础。 相似文献