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RNA干涉及其应用 总被引：1，自引：0，他引：1
在各种各样的真核生物当中,双链RNA(dsRNA)促使了有效的同源mRNA分子降解,这个过程被称为RNA干扰(RNAi)。RNAi现象通过调控RNA抑制基因表达,它在植物、动物、真菌中广泛存在,被认为是一种抑制病毒性复制和转座子活动的抗御机制,而在此过程中,侵染型病毒为了能够不被这种机制干扰抑制,继续在寄主体内生存、繁殖,则产生了一种反抗御机制———即产生抑制蛋白来对付转录后基因沉默(PTGS)。对RNAi以及RNAi抑制物的作用机制、抑制物类型、特点及相关应用方面作了比较详尽的综述。dsRNA介导的PTGS将是分子生物学领域的研究热点之一,在研究基因功能,基因治疗,抗病毒基因工程,解剖和调控次生代谢途径等方面有着广泛的应用前景。 相似文献
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转录后基因沉默现象广泛存在于植物、动物和真菌中。在植物中转录后基因沉默现象是对外来病毒入侵的一种防御机制。植物病毒既是转录后基因沉默的起始物、靶目标，又是编码抑制转录后基因沉默的蛋白。已经发现3种病毒抑制子作用于转录后基因沉默的不同阶段：烟草蚀刻病毒蛋白（HC-Pro）作用于转录后基因沉默的持续阶段，产生25nt小RNA的上游和产生沉默信号的下游区域；马铃薯x病毒蛋白（P25）和黄瓜花叶病毒蛋白（CMV2b）作用于转录后基因沉默的信号阶段。 相似文献
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双链RNA激发的植物基因沉默及其在植物育种上的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
在生物体内,存在大量的非编码RNA(ncRNA),小干扰RNA(siRNA)是其中一种,由双链RNA切割形成,能干扰基因表达,激发转录后的基因沉默。尽管双链RNA干扰是把基因"敲低"而不是"敲除",但它的高效和易操作性使之成为研究植物基因功能的有用工具,并通过转基因途径用于植物改良。与反义RNA技术和共抑制技术相比,RNA干扰对基因的沉默效率高,效果稳定。单基因RNA干扰就可调控多基因家族控制的农艺性状,而不必累积单基因突变。把病毒基因构建成反向重复结构转入植物体内,其转录出的RNA会通过分子内序列互补形成双链结构,激发转基因植物的RNA干扰机制,将入侵病毒的同源序列降解,使转基因植株获得对病毒的抗性。RNA干扰型抗病毒转基因植株中,转病毒基因的mRNA不存在或存在量很少,也不会翻译成有功能的病毒蛋白质,因此不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在生物风险,具有较高的生物安全性。 相似文献
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《农业科学学报》2017,(12)
Being a major class of single-stranded DNA viruses, geminiviruses are mostly studied due to their catastrophic infectious effect on crops. These DNA viruses are characteristic for their ability in quickly multiplying viral genetic materials without integrating into the genome of plants, which makes them ideal for developing viral vectors for plants bioengineering. Geminivirus-derived vectors can be classified into expression vectors and virus-induced gene silencing(VIGS) vectors. Details of the design, construction, application and improvements of these geminivirus vectors are summarized and discussed. 相似文献
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植物病毒编码RNA沉默抑制子的研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
RNA沉默是真核生物用来抵抗病毒入侵的一种普遍而又古老的防御机制，而病毒在进化过程中也相应地产生了一些与之抗衡的功能，其中编码沉默抑制子就是对抗RNA沉默的有效策略。它们分别能够在不同阶段，以不同的方式干扰来自于寄主的RNA沉默，从而有效地建立侵染。本文主要针对目前已经发现的由植物病毒编码RNA沉默抑制子的作用特征、鉴定方法以及作用副效应进行综述，并讨论了RNA沉默抑制子的研究及应用前景。 相似文献
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植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上,转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用,转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。 相似文献
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果树病毒载体研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
植物病毒载体作为重要的研究工具被广泛运用于蛋白表达、基因沉默等研究,当前普遍使用的是以烟草花叶病毒载体等为代表的草本植物病毒载体,但其大多不能侵染果树,且稳定性较差,容易丢失插入的外源基因,因此该类载体无法满足果树等多年生植物研究的需要。近年来新兴的果树病毒载体可解决这些难题,为此作者对果树病毒载体的研究进展和发展方向进行综述。当前国内外取得的研究成果主要包括：（1）通过掌握柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒、葡萄病毒A和葡萄卷叶伴随病毒等果树病毒的传播途径、寄主范围、致病力分化、基因功能和表达策略等特性,采用体外转录或农杆菌介导的方式获得了上述果树病毒的全长侵染性克隆。在此基础上,通过在病毒外壳蛋白基因与其邻近的上游基因之间插入外源基因（包括荧光蛋白基因和β-葡萄糖醛酸酶基因等报告基因）,并用该病毒外壳蛋白基因的启动子或其他异源启动子驱动外源基因表达的方式,将上述6种果树病毒的全长侵染性克隆改造成为病毒载体;（2）运用果树病毒载体明确了柑橘衰退病毒、柑橘叶斑病毒、李痘病毒、苹果潜隐球形病毒和葡萄卷叶伴随病毒在植株中的分布、移动规律,及其在细胞中的定位。探寻了柑橘衰退病毒在大翼来檬上产生茎陷点症状的原因,以及交叉保护防治柑橘衰退病的主要机理。果树病毒载体还被作为病毒诱导的基因沉默载体用于基因功能和防病研究;（3）通过选用本地已经存在,且无虫传能力的弱毒株,以及对控制病毒致病和媒介传播能力的基因进行敲除、突变可以解决果树病毒载体研发过程中所遇到的安全风险。由于有些果树病毒仅分布于植株的韧皮部,因此限制了其作为病毒载体在植株中表达外源基因的范围,但由这类果树病毒构建的病毒载体稳定性极高,并且通过添加分泌信号肽基因等方式可以扩大表达产物在植株中的分布和作用范围,因此其在果树病毒研究方面仍然具有很高的应用价值。此外,采用不同病毒来源的异源启动子代替同源重复区来驱动外源基因的表达,可以进一步提高果树病毒载体的稳定性。 相似文献
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为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。 相似文献
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RNA-dependent RNA polymerases,viruses, and RNA silencing 总被引：1，自引：0，他引：1
Ahlquist P 《Science (New York, N.Y.)》2002,296(5571):1270-1273
Most viruses have RNA genomes that are replicated and transcribed into messenger RNA by viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRps), usually in concert with other viral and host factors. Many, if not most, eukaryotes also encode putative RdRps that have been implicated in sequence-specific, RNA-triggered gene silencing. Although the viral and cellular RdRps have no sequence homology, they share functional similarities such as copying messenger RNA templates and intercellular spread of the amplified sequences. Better understanding of viral and host RdRps will improve our ability to control viruses and to use RNA silencing and viruses as tools for research, biotechnology, and medicine. 相似文献
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植物和病毒在基因水平上的互作是植物感病和抗病的分子基础。以模式植物烟草及其3种RNA病毒（马铃薯Y型病毒,Potato virus Y,PVY;烟草花叶病毒,Tobacco mosaic virus,TMV;黄瓜花叶病,Cucumber mosaic virus,CMV）为试材,旨在研究受病毒共同诱导、并可能在植物抗病反应中具有重要功能的转录因子基因。试验首先获得10个受病毒诱导的烟草同源基因。在比较了3种病毒侵染、低温和盐害协迫以及逆境信号物质(茉莉酸甲酯与水杨酸)处理对上述基因表达的影响后发现, 3种RNA病毒所诱导的植物基因有所不同。但属于WRKY基因家族的06G基因受3种病毒的共同、高效诱导,其表达水平与叶片发育程度呈负相关。研究结果表明, 该基因在植物病毒病发生及植物抗病分子育种中可能有重要意义。 相似文献
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利用i TRAQ技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)HM-40中筛选并克隆到S-腺苷甲硫氨酸合成酶Gh SAMS基因。Gh SAMS基因的开放阅读框全长为1 182 bp,编码393个氨基酸,预测Gh SAMS蛋白质含有15个磷酸化位点,推测其功能的行使可能与激酶磷酸化相关,进化分析表明S-腺苷甲硫氨酸合成酶与茶树(Camellia sinensis)的SAMS蛋白质相似性最高。q RT-PCR分析表明,在接种黄萎病菌VD07菌系后,Gh SAMS表达量逐渐增加,随着接种时间的延长,其相对表达量随之增加,推测其在陆地棉抗黄萎病防卫反应中可能起重要作用。在嫁接棉株中,利用VIGS技术成功地沉默Gh SAMS基因,然后对沉默棉株接种黄萎病菌VD07,鉴定其病情指数为62.5,抗性级别为感病;而转化空载体和未接种载体处理的嫁接棉株病情指数分别为30.0和31.2,抗性级别为耐病,表明Gh SAMS基因沉默后嫁接棉对黄萎病的抗性丧失。推测Gh SAMS基因在陆地棉抗黄萎病的过程中可能起重要作用。 相似文献
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对烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默分析体系中目前最常用的对照载体——空pYL156载体(pYL156∷00)对沉默处理后番茄和本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株的病毒症状和生长影响进行分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的番茄和本氏烟植株均表现出严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,因此,pYL156∷00并不是一个用于TRV诱导的番茄和本氏烟基因沉默分析的好的对照载体;为获得更好的对照载体,试验构建了2个新的对照载体pYL156∷NIRi和pYL156∷eGFP,它们分别通过在pYL156∷00载体多克隆位点插入253bp菜豆亚硝酸还原酶基因内含子序列和400bp eGFP基因片段而获得,对这2个对照载体对沉默处理后本氏烟植株的病毒症状和生长情况的影响与pYL156∷00进行比较分析.结果表明:pYL156∷00沉默处理后的植株表现出较严重的系统性病毒症状,生长受到显著抑制,其中26.7%植株死亡;pYL156∷NIRi沉默处理后的植株也表现出明显的病毒症状以及生长受抑制现象,但与pYL156∷00相比,所受影响较小,只有13.3%植株死亡;而pYL156∷eGFP沉默处理后的植株不表现明显的病毒症状,植株生长也不受显著影响;病毒积累量检测结果显示,3个对照载体沉默处理的植株病毒症状和生长受抑制情况与植株体内TRV病毒的积累水平密切相关.这些结果表明,新构建的pYL156∷eGFP可以作为一个优越的对照载体应用于TRV诱导的基因沉默分析. 相似文献
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【目的】探究苹果白粉病相关基因MdWRKY40b调控苹果抗白粉病的机理,为苹果白粉病的抗性育种提供理论依据。【方法】以苹果品种‘嘎拉’叶片为材料提取总RNA,并以cDNA为模板克隆MdWRKY40b 552 bp特异性片段,采用Gateway技术将该基因片段的正反向序列构建入RNAi表达载体pB7GWIWG2(Ⅱ)中,然后利用农杆菌介导法对苹果叶片进行转化获得转基因植株,苹果叶片选用组培苗茎尖处幼嫩叶片;利用RT-qPCR技术对转基因植株中MdWRKY40b、超氧化物歧化酶基因（SOD）、过氧化氢酶基因（CAT）、过氧化物酶基因（POD）以及β-1,3-葡聚糖酶基因（β-1,3-glucanase）的表达量进行分析;进一步以1年生植株为材料,通过白粉病菌（Podosphaera leucotricha）接种试验,分析转基因植株对白粉病的抗病性;然后以接种白粉病菌后0、5、10、15、20 d的转基因植株及其对照植株叶片为材料,进行氯化硝基四氮唑蓝液（NBT）和二氨基联苯胺法（DAB）染色来分析病菌侵染期间植物材料中超氧阴离子和过氧化氢的积累量,进一步对病菌侵染期间植株中SOD、POD、CAT和β-1,3-葡聚糖酶等酶活性进行测定。【结果】经过PCR检测,确定获得3个MdWRKY40b基因沉默株系,分别为RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3;RT-qPCR结果显示3个转基因株系MdWRKY40b基因沉默效率分别为95.2%、92.2%、79.8%,转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的表达量相较野生型显著上调;人工接种白粉病菌后发现,与野生型植株相比,转基因植株叶片中的粉状病斑显著减少,超氧阴离子和过氧化氢的积累量显著降低,SOD、CAT、POD等调节植物超氧阴离子代谢的抗氧化酶以及抗病相关的β-1,3-葡聚糖酶的活性显著增强。【结论】MdWRKY40b的沉默使得苹果植株对白粉病的抗病性增强,推测转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的上调表达提高了苹果植株对白粉病的基础抗性,导致植物对超氧阴离子的清除能力增加,维持了植物体在响应病菌侵染过程中的低浓度超氧阴离子含量,从而减少高浓度超氧阴离子对植物的损伤。 相似文献
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RNA: guiding gene silencing 总被引：1，自引：0，他引：1
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用反义RNA技术创造高直链淀粉玉米材料 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】利用反义RNA技术调控玉米淀粉的生物合成过程,创造高直链淀粉玉米材料。【方法】克隆玉米淀粉分支酶(sbe2a)基因片段,以载体pWGLL为基础,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系铁7922中。【结果】获得了4株转基因株系,GFP表达检测、PCR扩增和Southern杂交结果表明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。对4株转基因植株进行RT-PCR和淀粉分支酶活性检测,结果表明转反义sbe2a玉米淀粉分子酶基因的转录受到了明显抑制,淀粉分支酶活性明显低于野生型,相差最多的降低79.4%;直链淀粉含量也发生明显的变化,最高的提高了84.3%,且总淀粉含量与对照之间基本没有差异。【结论】采用反义RNA技术通过沉默内源sbe2a,可获得高直链淀粉含量的玉米材料。 相似文献