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【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。 相似文献
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TaqMan探针实时定量PCR检测肉中单增李斯特菌的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列设计一对引物和一条TaqMan探针,在分析特异性基础上,构建阳性重组质粒进行荧光定量PCR扩增,制备标准曲线,分析敏感度。进一步将该方法应用到人工染菌肉样中,分析其最低检出限。结果表明,该方法对10株单增李斯特菌均可产生特异性扩增曲线,其他6株非单增李斯特菌不产生扩增曲线,表明该方法具有较强的特异性。对阳性重组质粒定量扩增所建立标准曲线的相关系数为0.998,敏感度为19.5 copies.μL-1。该法对人工染菌肉样中单增李斯特菌的最低检出限为2.8×102cfu.g-1。该方法特异性强、敏感性高,可为肉中单增李斯特菌的快速、准确的定量检测奠定基础。 相似文献
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同时检测四种病原菌的PCR方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
(目的)为建立一种同时检测四种常见动物源致病菌的PCR方法.(方法)本研究针对大肠杆菌的(16s-23s rRNA)基因、金黄色葡萄球菌的(nuc)基因、单增李斯特氏杆菌的(hlyA)基因以及沙门氏菌的(invA)基因分别设计合成了四对特异性引物,PCR扩增的目的基因片段分别为662 bp、484 bp、372 bp、284 bp,并对多重PCR反应条件进行了优化.(结果)建立的多重PCR方法具有敏感、特异、准确、快速的优点,检测时间为4h左右.(结论)为研发同时检测人畜共患病食源性主要致病菌即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌及沙门氏菌的试剂盒奠定了基础. 相似文献
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为建立同时检测兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的双重PCR检测方法,本研究根据金黄色葡萄球菌的nuc基因和支气管败血波氏杆菌的fimN基因的保守序列设计2对特异性引物,通过优化反应条件,成功建立兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法。该方法对兔多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和魏氏梭菌的检测结果为阴性;能够检出5pg的金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的基因组DNA;与单重PCR检测方法的符合率为100%。说明本试验建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和准确性,为兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的鉴别诊断提供了有效的技术手段。 相似文献
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《河南农业大学学报》2014,(5)
以金黄色葡萄球菌clfa基因和溶血性链球菌sdy基因为靶基因设计引物.通过对单个基因PCR和多重基因PCR扩增进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系,建立了快速检测溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌的双重PCR方法.在郑州市不同地区随机抽检126份生鲜猪肉样品,分别进行了双重PCR检测和常规微生物学检验.结果表明,建立的双重PCR方法特异性好,抗干扰能力强,灵敏度可达到102ng·L-1.在126个样品中检测出溶血性链球菌的样品数为7份,检出率为5.55%;检出金黄色葡萄球菌阳性的样品数为8份,检出率为6.35%. 相似文献
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建立牛奶乳样中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法。根据产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A基因序列分别设计了2对特异性引物,分别从产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌参考菌株的肉汤培养物中提取DNA,进行PCR扩增,并进行特异性、敏感性试验和临床样品检测。经过PCR反应条件的优化,建立了产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法,均扩出了相应的目的条带。该方法将参考菌株的肉汤培养物稀释1 000倍后仍可扩出目的条带,且对大肠埃希菌等的PCR检测为阴性。对临床采集的50份乳品样本分别用细菌分离培养法和PCR方法进行检测,两种方法的符合率达90%以上,但双重PCR检测方法具有特异性强和敏感性高的特点。 相似文献
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为建立一种快速、准确的猪霍乱沙门菌现场检测方法,针对猪霍乱沙门菌侵袭蛋白A(Invasion protein A,invA)基因序列设计特异性引物和探针,优化反应条件,建立重组酶聚合酶等温扩增结合侧向流层析试纸条（RPA-LFS）检测方法。结果表明：建立的方法在39℃等温条件下15 min内即可特异性检出猪霍乱沙门菌,与金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、铜绿假单胞菌、单增李斯特菌无交叉反应,该方法对猪霍乱沙门菌的最低检出限为1 CFU/反应;应用该方法对50份猪肉样本进行检测,与PCR方法检测结果一致。建立的猪霍乱沙门菌现场RPA-LFS检测方法敏感性高、特异性强、反应快速、操作简便的特点,可应用于猪霍乱沙门菌的临床快速检测。 相似文献
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4种食源性致病菌多重PCR检测技术的研究及应用 总被引：4，自引：0，他引：4
为建立一种利用多重PCR技术检测和鉴定沙门氏菌(Salmonellla spp)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的方法,根据沙门氏菌侵袭力蛋白A基因(invA gene)、单核细胞增生李斯特菌蛋白转录调控基因(prfA gene)、金黄色葡萄球菌自溶素基因(alt gene)、蜡样芽孢杆菌的促旋酶B亚单位基因(gyrB gene)设计引物,进行多重PCR扩增,并对多重PCR反应体系进行优化。在此基础上建立了4种致病菌的多重PCR检测体系,同时以国标法进行对比验证。结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高,具有很好的应用前景。 相似文献
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根据克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)16S rRNA基因以及局部大分子合成(MMS)操纵子特异序列设计2对引物,经反应体系和条件优化,建立了双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,Cronobacter spp.菌株PCR扩增均可见2条特异性条带,而其他菌株PCR扩增均为阴性。纯菌检测双重PCR的灵敏度为6.3×103 CFU.mL-1,而相对应单重PCR的灵敏度分别为6.3×101 CFU.mL-1和6.3×103 CFU.mL-1;人工污染的食品样品(奶粉、牛奶、鸡肉)在经过24 h增菌后,检测限均可达100 CFU.mL-1或100 CFU.g-1。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在的条件下,双重PCR的检测限没有受到影响。表明本试验建立的双重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能克服食品样品基质及杂菌的干扰,可应用于食品中Cronobacter spp.的检测。 相似文献
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三种常见食源性致病菌的多重PCR快速检测 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立对3种食源性致病菌—大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的快速、敏感、特异的多重PCR诊断检验方法,本研究设计了上述3种菌的特异性PCR引物,通过单一、双重及三重PCR反应检测,并对人工感染的饮料和面包2种食品进行验证.结果表明,3种食源性致病菌的单一、双重和三重PCR均成功扩增出目的片断,没有非特异性扩增.人工感染食品的PCR检测也获得了目的菌的特异性片段,并且结果稳定.本研究所建立的多重PCR反应系统具有较好的特异性和灵敏性,为食品中常见致病菌的检测提供了一种快速、简便、可靠的方法,具有重要的理论意义及实践意义. 相似文献
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Detection of Staphylococcus aureus in Dairy Products by Polymerase Chain Reaction Assay 总被引：1，自引：0，他引：1
YANG Yang SU Xu-dong YUAN Yao-wu KANG Chun-yu LI Ying-jun ZHANG wei ZHONG Xiao-ying 《中国农业科学(英文版)》2007,6(7):857-862
A polymerase chain reaction （PCR） assay was employed for direct detection of Staphylococcus aureus without enrichment in dairy products. A solvent extraction procedure was successfully modified for the extraction of Staphylococcus aureus DNA from artificially contaminated whole milk, skim milk, and cheese. A primer targeting the thermostable nuclease gene （nuc） was used in the PCR. A DNA fragment of 279 bp was amplified. The PCR product was confirmed by DNA sequencing. In this study, the PCR, GB-4789.10-94, Perifilm RSA.Count Plate, and Baird-Parker ＋ RPF Agar were compared. The sensitivity of the PCR was 10 CFU mL^-1 of whole milk, skim milk, and 55 CFU g^-1 of cheese. The developed methodology allowed for detection of Staphylococcus aureus in dairy products in less than 6 h. The time taken for the development of this PCR assay was 12-24 h, less than the time taken by the general PCR assay using the enrichment method, and the coincidence rate of this developed PCR was 94.3%, the sensitivity was 100%. It was a rapid, sensitive, and effective method for PCR to detect Staphylococcus aureus in milk and milk products. 相似文献
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[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特氏菌和空肠弯曲杆菌检测的基因芯片方法,并在实际应用中检测芯片的效果。[方法]以5种目标菌保守基因片段为模板设计引物,用待检样品增菌后提取的DNA模板进行2个独立的多重PCR扩增。扩增产物与固定有5种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交,用芯片扫描仪对芯片杂交结果进行扫描并判定结果。[结果]使用基因芯片检测5种细菌的检测下限分别为：金黄色葡萄球菌8.7×105cell/ml;大肠杆菌O157：H7 5.0×105cell/ml;沙门氏菌4.4×105cell/ml;单增李斯特氏菌2.4×105cell/ml;空肠弯曲杆菌6.2×106cell/ml。[结论]与传统方法比较,芯片法具有较高的特异性和灵敏性,是一种能应用于实际的快速高通量检测细菌的方法。 相似文献
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食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究 总被引：11，自引：0，他引：11
传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义。本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR（multiplex PCR）条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法。通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明：该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增茵4～8h其最低检出限可达1cfu／mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域。 相似文献
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冰鲜鸡肉中致病菌三重PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：1，他引：2
【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103 CFU/mL,单重的灵敏度达到101 CFU/g,模拟实际样品检测中,经过20 h的前增菌后,三者同时检出的灵敏度达到101 CFU/g,单重PCR的灵敏度达到100 CFU/g;对60份屠宰线上的鸡胴体样品和32份超市鸡肉样品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的检出率分别为20%、3.3%、21.7%(屠宰线样品)和25%、21.9%、6.25%(超市样品)。【结论】成功建立了可同时检出鸡肉中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157的三重PCR方法,可为生产一线的致病菌检测提供参考。 相似文献
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多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中LM的快速检测。 相似文献
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用画线接种的方法把58株从堆肥中分离的细菌接种于只含琼脂粉和水分的平皿上,室温培养数天后发现有1株细菌(BR5-1)能明显长出菌落。用这株细菌接种于含琼脂粉(2、8g·L-1)的无菌水悬液以及对照生理盐水和LB中,摇床培养48h后稀释倒平皿测活菌数。结果表明,活菌浓度在含琼脂粉的液体中(6.5×103、6.0×103cfu·mL-1)明显比在对照处理生理盐水(6.1×102cfu·mL-1)中高,但是明显比在对照处理LB培养基(1.1×108cfu·mL-1)中低。试验表明这株菌能够降解琼脂粉。 相似文献