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为了探究火龙果溃疡病病原菌的致病机理,笔者利用农杆菌介导的遗传转化技术,分析了根癌农杆菌浓度、分生孢子萌发时间以及共培养温度等3个主要因素对遗传转化效率的影响,建立火龙果溃疡病菌的遗传转化技术体系,并对转化子进行筛选。结果表明,当农杆菌浓度OD600=0.5、分生孢子萌发时间24 h、共培养温度25 ℃时遗传转化效率最高（833个转化子/106分生孢子）;随机挑选200个转化子进行筛选,获得3株菌落形态与野生型菌株差异较大的转化子,4株产孢量减少的转化子,5株产孢量增加的转化子,6株致病力下降的转化子。 相似文献
2.
【目的】链格孢菌（Alternaria alternate）苹果致病型是苹果上的重要致病菌,可以侵染苹果叶片和果实。论文旨在建立农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型高效稳定的分子转化体系,为在分子水平上研究链格孢苹果致病型病菌的致病机制提供技术支持。【方法】质粒pKO1-HPH是以pCAMBIA1300骨架为基础构建的穿梭质粒,含有潮霉素抗性基因,并在其多克隆位点上插入了绿色荧光蛋白基因,这个质粒在大肠杆菌和农杆菌细胞中都能够稳定地复制繁殖。将质粒pKO1-HPH采用冻融法转化到农杆菌菌株AGL1中,然后与链格孢苹果致病型菌株XP-1的分生孢子在诱导培养基上共培养进行基因转化,转化子在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选;在含有50 μg·mL-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上检测转化子细胞中抗性基因在转化子中的表达情况;用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白基因在转化子细胞中的表达情况。在初步确认可以将绿色荧光蛋白和潮霉素B磷酸转移酶基因转入链格孢苹果致病型菌株中后,对菌落培养时间、转化前分生孢子的预处理方法对转化效率的影响进一步优化。转化子的稳定性采用分生孢子5次继代培养后,能否在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上稳定生长来检测;采用PCR方法检测绿色荧光蛋白外源基因和潮霉素B磷酸转移酶基因是否存在于转化子基因组中;用Southern杂交检测外源基因在转化子基因组中插入的拷贝数;在苹果果实和叶片上接种检测转化子致病性的变化。【结果】将100 μL孢子悬浮液（含105孢子）涂布于马铃薯-胡萝卜-琼脂平板上菌落培养36-48 h后,链格孢苹果致病型菌株XP-1可以产生足量的孢子用于农杆菌介导的分子转化。将分生孢子用无菌水洗下,在4℃处理6 h,再与含质粒pKO1-HPH的农杆菌进行诱导共培养,转化子在含有50 μg·mL-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选,转化效率较好,107个分生孢子转化可获得约200个转化子。转化子经过5次继代培养,对潮霉素B的抗性没有改变。特异性引物PCR检测表明外源基因能够成功地整合到供试菌株的基因组中;Southern杂交表明外源基因多以单拷贝形式随机插入到链格孢苹果致病型菌株XP-1细胞的基因组中;转化子的菌丝和分生孢子在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光,说明荧光蛋白基因在菌丝及孢子中均能够成功表达。通过部分转化子的致病性试验,筛选获得数个在苹果果实和叶片上致病性都显著降低的菌株。【结论】建立了农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型稳定高效的分子转化体系,为进一步开展此病菌与其寄主的分子互作研究打下基础。 相似文献
3.
玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析 总被引：3，自引：2，他引：1
【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。 相似文献
4.
《西南农业学报》2020,(8)
【目的】建立农杆菌介导荸荠秆枯病菌(Cylindrosporium eleocharidis)的遗传转化体系,构建该病菌的突变体库并进行突变体筛选,为荸荠秆枯病病原菌的分子机理研究提供参考依据。【方法】运用农杆菌介导的真菌转化方法,将含有绿色荧光蛋白(GFP)的双元载体pEX4转化至荸荠秆枯病菌野生型菌株Ceh中,利用PCR、Southern blotting杂交和荧光显微镜检测等技术验证转化子。通过单因子变量[共培养基中的乙酰丁香酮(AS)、农杆菌诱导时间、病原菌孢子浓度、IM诱导培养基pH、共培养时间和共培养介质]试验,优化农杆菌遗传转化体系,并建立该病菌突变体库,分析突变体的形态变异和致病性。【结果】获得的最佳遗传转化条件为:共培养基中AS浓度为300μmol/L,农杆菌诱导时间6 h,真菌孢子浓度为10~7个/mL,诱导培养基pH 5.6,共培养时间72 h,共培养介质为硝酸纤维素膜。在该优化条件下,农杆菌遗传转化体系转化效率达600～700个转化子/10~7个孢子。随机挑取转化子进行PCR检测均为阳性,T-DNA单拷贝插入率达77.8%,荧光显微镜均可检测到荧光信号。【结论】成功构建了农杆菌介导的荸荠秆枯病病原菌遗传转化体系和T-DNA插入突变体库,并筛选获得表型和致病性缺陷突变体,可用于指导荸荠秆枯病菌基因功能和病菌与寄主互作研究。 相似文献
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【目的】通过农杆菌介导的遗传转化（ATMT）方法,建立香蕉枯萎病4号生理小种的高效转化体系,构建病原菌的突变体库并进行筛选,为已突变基因提供分子标记,在分子水平上对香蕉枯萎病菌的功能基因进行深入研究。【方法】通过单因子变量（试验材料、真菌孢子浓度、农杆菌预诱导终浓度、IM诱导培养基pH、共培养介质、共培养时AS浓度、共培养温度）试验,研究影响农杆菌介导的遗传转化效率的关键因素,并通过形态观察与致病性试验筛选突变体。【结果】得到的最佳转化条件为：农杆菌预诱导浓度OD600=0.8,病原菌孢子浓度106 CFU/mL,转化受体材料为分生孢子,共培养培养基pH 5.4,共培养温度25 ℃,共培养培养基中AS浓度200 μmol/L,共培养介质为硝酸纤维素膜。通过条件优化,转化效率可达到800-900个转化子/106个孢子。【结论】通过农杆菌介导的遗传转化成功将GFP基因转入病原菌中并表达,构建了病原菌的T-DNA插入突变体库,并通过筛选得到多个表型和致病性发生变化的突变体,为香蕉枯萎病菌基因组功能注释的研究奠定了基础。 相似文献
6.
【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。 相似文献
7.
观察了农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌株RoseBc-3的影响因素,并对遗传转化的有效性进行评估.结果表明:农杆菌与灰葡萄孢共培养的温度和灰葡萄孢分生孢子浓度均能影响转化效率,当共培养温度为22℃、灰葡萄孢分生孢子浓度为1×105个/mL时,转化效率最高,平均每平皿(直径9 cm)转化子数量超过100个;通过特异性引物介导的PCR和特异性探针杂交方法,证明所获得的转化子是农杆菌中T-DNA插入造成的,且大多数(87.5％)T-DNA插入为单拷贝插入;从灰葡萄孢T-DNA插入体库筛选获得了6类突变体,即产孢显著减少或不产孢突变体(占3.8％)、菌丝生长速率减慢突变体(占3.5％)、菌丝稀疏突变体(占1.6％)、菌落颜色异常突变体(占5.7％)、致病力丧失突变体(占3.3％)和致病力增强突变体(占3.0％).采用反向PCR技术和hi-TAIL PCR技术从14个灰葡萄孢突变体菌株中获得了T-DNA侧翼序列,且发现T-DNA在基因编码区和非编码区插入的频率是相同的. 相似文献
8.
以尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)FO-11-06菌株为受体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(含pATMT1)介导的西瓜枯萎病菌的转化,并研究了转化介质和pH值对转化效率的影响。结果表明:在25℃下,采用乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600=0.15、尖孢镰刀菌分生孢子含量为1×106个/mL、pH值为5.1～5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH值为5.3时,转化效率最高,达到每106个分生孢子产生553个转化子。不同共转化介质对转化效率影响明显,玻璃纸和硝酸纤维素滤膜转化效率较高,每106个分生孢子获得551个和549个转化子,显著高于滤纸。通过转化,获得尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子1 989个,对生长速度、菌落颜色和产孢量等性状进行分析,发现有46个性状特异的突变体。研究结果为进一步研究尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长发育、致病机制和相关基因的功能奠定了基础。 相似文献
9.
《江苏农业学报》2017,(2)
为建立梨炭疽病菌的原生质体遗传转化体系,以梨炭疽病菌菌株II-17为供试菌株,研究了菌龄、酶解液组合及酶解时间等对梨炭疽病菌原生质体制备的影响。结果表明,制备梨炭疽病菌原生质体的适宜条件为:CM液体培养基培养分生孢子24 h后,再转接到新的CM液体培养基中培养24 h,获得新鲜的菌丝;最适酶解液组合为9.0 mg/ml裂解酶+1.0 mg/ml崩溃酶+1.0 mg/ml蜗牛酶;酶解时间为2.5~3.0 h时酶解效率最高。对获得的转化子进行PCR鉴定和荧光观察,结果表明,GFP标记基因已成功整合到梨炭疽病菌的基因组中,转化子发出强烈的绿色荧光且遗传性稳定。致病性测定结果表明,转化子致病性与野生型菌株无明显差别,成功获得了梨炭疽病菌的GFP标记菌株。 相似文献
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根癌农杆菌介导的玉米大斑病菌转化条件的优化 总被引：2，自引：0，他引：2
为构建大规模的玉米大斑病菌ATMT突变体库,本研究对根癌农杆菌介导的玉米大斑病菌的转化条件进行了优化,包括共培养温度与时间、孢子萌发时间、转化受体材料、共培养介质等。结果表明:头孢噻肟钠和羧苄青霉素浓度为200/200μg/mL时可有效抑制根癌农杆菌的生长;当玉米大斑病菌分生孢子萌发24 h后,在20℃条件下与根癌农杆菌共培养48 h,共培养介质为微孔滤膜时转化效果最佳,转化效率可达到90～110个转化子/105个孢子。 相似文献
11.
【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL -1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL -1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。 相似文献
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Tremellafuciformis is one of higher basidiomycetes. Its basidiospore can reproduce yeast-like conidia, which is also called the blastospore by budding. The yeast-like conidia of T. fuciformis is monokaryotic and easy to culture by submerged fermentation similar to yeast. Thus, it is a good recipient cell for exogenous gene expression. In this study, the expression plasmid pAN7-1 （containing promoter gpd-An derived from Aspergillus nidulans and selectable marker gene hph conferring resistance to hygromycin B） and plasmid pLg-hph （containing promoter gpd-Le derived from Lentinula edodes and selectable marker gene hph） were transformed into the yeast-like conidia of T. fuciformis by PEG-mediated protoplast transformation, respectively. The primary putative transformants were selected by the sandwich screening method with the selective medium containing 50 μg mL^-1 hygromycin. The putative transformants were obtained from the primary putative transformants transferred on PDSA plates containing 100 μg mL^-1 hygromycin for second round selection. Experimental results showed that the optimal concentration of PEG 4000 for mediating protoplast transformation was 25%. PCR and Southern blotting confirmed that the selectable marker gene hph was integrated effectively into the genome of the yeast-like conidia of T. fuciformis with plasmid pLg-hph transformation. Its transformation efficiency was 110 transformants per μg DNA, and the hph gene was integrated into the genome of some yeast-like conidia with plasmid pAN7-1 transformation. However, its transformation efficiency was only 9 transformants per μg DNA. The presence of hph gene in the genome of transformants after 5 generations of sub- culturing on PDSB medium was confirmed by PCR, suggesting that the foreign gene hph was stable during subculture. 相似文献
13.
采用根癌农杆菌AGL-1介导的方法,对生防青霉Penicillium striatisporum Pst10进行绿/黄色荧光蛋白-遗传霉素抗性双标记,研究标记前后菌株的生长差异以及拮抗性能的变化.以Pst10的新鲜菌丝体为受体,获得12个青霉Pst10的绿色荧光蛋白-遗传霉素抗性(GFP-Gen)双标记菌株,转化率0.24%;获得14个青霉Pst10的黄色荧光蛋白-遗传霉素(YFP-Gen)抗性双标记菌株,转化率0.28%.在所获得的转化子中,部分双标记转化子的生长速度和拮抗性能有不同程度的改变,分别筛选获得1株和3株生长速度和拮抗性能与野生型没有明显差异的GFP-Gen和YFP-Gen双标记转化子. 相似文献
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农杆菌介导瞬时沉默小麦HCP1的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立农杆菌介导的瞬时沉默小麦HCP1的方法,为简便、快速、高效地研究小麦基因功能提供一种可靠的技术支持。研究HCP1在叶锈菌侵染过程中对H2O2的清除作用,为阐明小麦抗叶锈菌侵染中信号转导机制奠定理论基础。【方法】采用农杆菌注射法,将携带有peGFP载体的农杆菌注射到小麦叶片中,观察叶片中荧光强度及分布,分析外源质粒在小麦叶片中的表达情况。通过注射EHA105、LBA4404和C58C1 3种不同的农杆菌菌株,将HCP1的RNAi载体导入小麦叶片细胞中,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测HCP1瞬时沉默效率,并结合Rohringer染色分析,明确不同农杆菌对寄主叶片侵染能力的强弱,从而筛选出最适的试验菌株。在瞬时沉默的小麦叶片上,接种不亲和叶锈菌小种260,利用DAB染色,观察接种叶锈菌后叶片中H2O2的变化,分析HCP1在小麦与叶锈菌互作过程中的功能。【结果】叶片GFP荧光观察结果说明,在注射农杆菌48 h后GFP开始出现较高表达。RT-PCR和qRT-PCR结果表明,注射C58C1菌株的叶片12 h后,HCP1的表达量开始降低,并持续保持较低的表达量。注射EHA105菌株的叶片,在注射后72-96 h,HCP1的表达量迅速降低。而注射LBA4404菌株的叶片中HCP1的表达量基本没有变化。所以在3种不同农杆菌菌株介导的HCP1 RNAi转化中,沉默效率依次为：C58C1≥EHA105＞LBA4404。注射不同农杆菌菌株叶片的Rohringer染色结果发现,EHA105侵染后引起的HR反应较其他两种菌株明显,说明EHA105对小麦叶片具有较高毒性,会引起叶片产生防卫反应,C58C1菌株在具有较高的沉默效率同时,对叶片的毒性较小,因此选取C58C1作为最适的试验菌株;沉默HCP1的小麦叶片接种叶锈菌小种260后,通过DAB染色发现,接种24 h和48 h后叶锈菌侵染诱发的小麦叶片H2O2的分布及积累量均多于对照组。【结论】建立了农杆菌介导的瞬时基因沉默体系,选用C58C1农杆菌菌株作为试验菌株,在处理后72 h可达到沉默目的基因的效果。确定HCP1参与了小麦与叶锈菌互作过程中H2O2的清除途径。 相似文献
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【目的】通过同源重组敲除技术,解析菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因VdPKAC1在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技术构建VdPKAC1的同源重组敲除质粒。该质粒的潮霉素抗性基因盒两端分别为靶标基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通过农杆菌AGL-1的介导,将该质粒的T-DNA区域整合到来源于棉花的菌丝型大丽轮枝菌V07DF2菌株中。从6个随机选择的含有潮霉素抗性基因片段的转化子中,通过靶标基因的PCR检测,获得了5个VdPKAC1基因敲除突变体。经过Southern杂交检测,选择了3个敲除突变体材料（2B5、C5和HH2）进行突变表型的观察和分析。在液体PDB培养7 d后观察敲除突变体与野生型菌株的黑色素产生情况;在固体PDA培养28 d后,观察敲除突变体与野生菌株的菌丝生长和休眠结构形成情况。此外,利用棉花根提取物对液体Cazpek-Dox培养7 d的各菌株分别进行诱导处理,在处理24、72 h后分别统计分生孢子数量,以此对敲除突变体和野生菌株的分生孢子产生能力进行评估。最后,将孢子浓度为1×107个/mL的突变体和野生菌株的分生孢子液灌根接种2叶期的棉花,测定其致病力。【结果】Southern杂交结果表明,在上述5个敲除突变体中,只有2B5和C5两个菌株为T-DNA单拷贝插入,而其他菌株均存在T-DNA异位整合的情况。在PDA培养条件下,3个敲除突变体（2B5、C5和HH2）与野生型相比具有黑色素合成增加,气生菌丝更加发达的特点。其中,敲除突变体2B5和C5在平板培养条件下还形成了野生型菌株没有的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。在棉花根提取物的诱导处理下,3个敲除突变体产生的分生孢子数量少于野生型菌株。另外,致病力分析结果表明,敲除突变体材料仍然具有一定的致病力,但却显著弱于野生菌株V07DF2。【结论】在大丽轮枝菌中,通过蛋白激酶A介导的环腺苷酸信号途径控制多种重要性状,而VdPKAC1是这一途径中的重要成员。以前的报道证实,VdPKAC1负调控微菌核的数量,而本研究利用菌丝型菌株V07DF2在PDA培养基上不产生微菌核的这一特性,通过同源重组原理敲除该负调控基因,成功获得可以在PDA上产生休眠结构的菌丝型大丽轮枝菌菌株的突变体。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。 相似文献
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【目的】论文旨在研究紫杉二烯合酶基因（ts）在灵芝中的表达情况,为利用灵芝作为生物反应器表达紫杉醇及其中间产物提供科学理论依据。【方法】制备灵芝菌株的原生质体：把培养好的灵芝菌丝用0.6 mol•L-1的甘露醇溶液洗涤两次后,加入1%溶壁酶溶液,30℃水浴酶解3 h,离心去上清液得到纯的灵芝原生质体,用0.6 mol•L-1的甘露醇溶液把原生质体的浓度调整到108个/mL备用;外源基因（ts）的转化：在含有灵芝原生质体的缓冲液各加入含有ts基因和潮霉素抗性基因hph的真核表达载体pgGIgpd-TS和pBgGI-hph 1.0 μg,冰浴30 min;加入0.5 mL PEG buffer,在室温下放置20 min;将离心收集的原生质体涂布在不含有潮霉素的再生平板上,25℃培养5-7 d后,待长出白色菌落后,往平板表层覆盖一层含有潮霉素的PDA半固体培养基,于25℃培养;转化子的鉴定：以灵芝的菌丝基因组DNA和RNA为模板,进行PCR和RT-PCR扩增,鉴定ts基因在灵芝中的表达情况;目标产物的检测：对提取的产物采用不分流进样的方式进行气相质谱联用（GC-MS）检测,进样温度250℃,初始温度100℃,保留1 min,每分钟升高8℃,加热到300℃,保留2 min。【结果】经潮霉素初步筛选后,在含有潮霉素抗性的平板上长出白色的菌落,灵芝原种作为阴性对照的平板上没有长出菌落,说明潮霉素基因被成功转入了灵芝并得到了初步的表达;PCR鉴定结果表明20个拟转化子中有4个转化子同时整合了ts基因和hph基因,两个基因的共转化率为20％;RT-PCR鉴定结果表明,4个灵芝转化子实现了外源ts基因的转录;提取转ts基因灵芝的菌丝产物;经过GC-MS测定分析表明,与原种相比,含有ts基因的灵芝工程菌株有一个明显的差异峰,对该峰进行离子碎片分析表明,该物质为紫衫二烯,说明在含有ts基因的灵芝菌丝体中含有目标产物紫衫二烯。【结论】灵芝作为大型真菌,首次被证实可以通过代谢工程生产合成紫杉醇过程中的中间产物紫杉二烯,为以后紫杉醇的生产提供一个潜在的可能,对今后开展灵芝的分子生物学研究具有重要意义。 相似文献