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为获得大量的、具有高度同一性和表型功能正常的山羊子宫内膜上皮细胞（EEC）,本试验将含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达质粒pCI—neo—hTERT导入原代山羊EEC中,筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定,利用免疫细胞化学方法检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达情况,探讨转染后细胞的生长特性。结果显示,转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈明显铺路石状。与原代细胞形态一致,具有接触抑制性;角蛋白检测阳性;细胞具有较高的端粒酶活性,目前已传至50代仍稳定增殖;100nmol／L的雌二醇（E2）可促进该细胞的增殖;50,100nmol／L的孕酮（P4）可明显抑制该细胞的增殖。这表明hTERT导入山羊EEC后,可使其重建端粒酶活性,从而获得大量的、具有高度同一性和表型正常的细胞。 相似文献
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山羊子宫内膜基质细胞永生化研究 总被引：3，自引：1，他引：2
将真核表达质粒pCI-neo-hTERT通过DNA转染技术导入山羊子宫内膜基质细胞(ESCs),筛选稳定转染的细胞克隆,进行表型鉴定、生长特性及E2、P4等性腺激素的反应性测定.结果,传至2代的山羊ESCs经转染pCI-neo-hTERT,G418筛选2～3周后,抗性克隆形成,滤纸片法转移,扩增并连续培养,共获得5个细胞克隆,扩大培养后的细胞呈典型的长梭形和三角形,相互平行排列成束,与原代培养形态一致.转染后细胞有较高的端粒酶活性,细胞增殖加速,传代时间缩短,传至50代仍稳定增殖.波形蛋白枪测阳性,角蛋白检测阴性,具有转染前山羊子宫内膜基质细胞特性.雌激素(100 nmol·L-1)和少量孕激素(10 nmol·L-1)对转染后基质细胞增殖有促进作用.获得了永生化的ESCs,为子宫内膜细胞体外研究奠定了基础. 相似文献
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hTERT永生化山羊子宫内膜基质细胞系的建立及其致瘤性 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国兽医学报》2014,(12):1976-1981
为了检测转染人端粒酶逆转录酶催化亚单位(human telomerase reverse transcrip tase,hTERT)后建立的山羊永生化子宫内膜基质细胞(endometrium stromal cells,ESCs)是否存在潜在致瘤性。将hTERT导入2代山羊ESCs中建立永生化山羊ESCs(hTERT-ESCs),利用免疫细胞化学方法鉴定细胞并检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达;分别取2代山羊ESCs和55代hTERT-ESCs,使用含不同浓度血清的培养液培养,利用MTT法检测其血清依赖性;软琼脂克隆形成试验检测hTERT-ESCs在半固体培养基中的克隆形成能力,同时测定hTERT-ESCs的生长曲线。结果显示:转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈长梭形和三角形,与原代细胞形态一致,波形蛋白检测阳性,角蛋白检测阴性;免疫细胞化学方法显示hTERT阳性;hTERT-ESCs在含不同血清培养基中生长速度不同,具有血清依赖性;软琼脂克隆试验显示2代山羊ESCs和55代hTERT-ESCs均不能在软琼脂中生长;hTERTESCs具有正常体细胞生长曲线。证明hTERT-ESCs基本保持了正常山羊ESCs的生物学特性,不具有致瘤性。 相似文献
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利用包含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达载体pCI-neo-hTERT转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选阳性克隆扩大培养,并对转染阳性细胞分别进行RT-PCR检测,倍性分析,细胞周期检测和细胞凋亡检测,以观察该基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响.试验结果表明,筛选出的阳性细胞现已传至第50代;RT-PCR检测,端粒酶基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞并持续表达;倍性分析结果显示,转基因第50代细胞呈正常二倍体;对细胞周期进行分析,结果显示转基因第50代细胞较未转染第30代细胞有较高的S期,说明该细胞DNA合成旺盛,具有很强的增殖能力;细胞凋亡检测结果发现,转基因第50代细胞中凋亡细胞的比例明显少于转染第30代山羊胎儿成纤维细胞.这些试验结果均表明,hTERT能增加山羊胎儿成纤维细胞体外培养的代数,并保持细胞良好的形态及较强的增殖能力. 相似文献
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人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
利用包含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达载体pCI-neo-hTERT转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选阳性克隆扩大培养,并对转染阳性细胞分别进行RT-PCR检测,倍性分析,细胞周期检测和细胞凋亡检测,以观察该基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响。试验结果表明,筛选出的阳性细胞现已传至第50代;RT-PCR检测,端粒酶基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞并持续表达;倍性分析结果显示,转基因第50代细胞呈正常二倍体;对细胞周期进行分析,结果显示转基因第50代细胞较未转染第30代细胞有较高的S期,说明该细胞DNA合成旺盛,具有很强的增殖能力;细胞凋亡检测结果发现,转基因第50代细胞中凋亡细胞的比例明显少于转染第30代山羊胎儿成纤维细胞。这些试验结果均表明,hTERT能增加山羊胎儿成纤维细胞体外培养的代数,并保持细胞良好的形态及较强的增殖能力。 相似文献
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用脂质体介导法将hTERT基因转染到山羊胎儿成纤维细胞中,以期获得永生化的山羊胎儿成纤维细胞系。对转染后的阳性细胞进行细胞学和分子学相关检测。结果显示,导入hTERT的阳性细胞形态正常,并已传至第58代;未转染组细胞经长期传代后（30代）,增殖缓慢,部分细胞表现衰老和凋亡的迹象。RT-PCR检测转染组细胞中有hTERT基因表达。生长曲线绘制结果显示转染组（30代和50代）山羊胎儿成纤维细胞生长速度稍快于未转染组（5代）细胞,但差异不显著（P〉0.05）。转染组细胞生长旺盛,细胞接种后第6天,基本覆盖培养孔。而未转染组（30代）细胞一直生长缓慢,差异显著（P〈0.05）。未转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞处于S期细胞和G1期细胞分别为28.9%和60.8%,而转染组（30代）分别为45.2%和45.0%。说明外源性hTERT基因可促进山羊胎儿成纤维细胞由G1期向S期转变,并提高细胞增殖能力。转染组（50代）山羊胎儿成纤维细胞染色体核型正常,未发生变化。未转染组（30代）细胞凋亡率和死亡率分别为39.7%和29.4%,而转染组（30代）分别为11.0%和12.7%,差异极显著（P〈0.01）。hTERT蛋白在转染组（30代）山羊胎儿成纤维细胞中表达,蛋白相对分子质量为127 000。说明外源性hTERT基因可以延长胎儿成纤维细胞在体外培养的寿命,降低细胞凋亡率。 相似文献
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为了研究外源性端粒酶(hTERT)基因导入后对原代培养猪气管黏膜上皮细胞(STECs)增殖活性的影响,试验将外源性hTERT基因转染至原代分离培养的STECs中,以脂质体法用重组质粒pCI-neo-hTERT转染STECs;通过倒置显微镜观察细胞形态,间接免疫荧光法鉴定8型角蛋白的上皮源性;用PCR和Western-blot法检测转染后STECs中hTERT基因的表达情况;用MTT法和流式细胞仪分别检测转染细胞的活力和增殖周期。结果表明:脂质体和质粒体积比会影响转染效率,当二者比例为1∶3时,转染效率最佳;转染细胞经PCR扩增得到大小为461 bp的片段,Western-blot检测得到大小为125 ku的条带;转染后的细胞仍然符合上皮源性细胞的生长特点;细胞活力曲线显示,在接种后的第3～5天细胞增殖速度最快;细胞周期测定显示,转染细胞的细胞核型为2倍体,S期细胞达到48.35%。说明原代培养的STECs转染外源性hTERT基因后,细胞增殖活性增高,并保持了基本的细胞生物学特征,有进一步建立稳定传代细胞系的可能。 相似文献
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羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。 相似文献
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【目的】试验旨在建立永生化蒙古马胎儿成纤维细胞(equine fetal fibroblasts, EFFs)系,为马繁殖与发育生物学研究提供参考。【方法】采用1 mg/mL胶原酶Ⅳ消化分离原代EFFs,利用表达人端粒酶逆转录亚基(hTERT)和潮霉素B抗性的pLV-hTERT-IRES-hygro慢病毒感染EFFs,经潮霉素B筛选得到阳性细胞hTERT-EFFs,以第3代EFFs为对照,采用实时荧光定量PCR检测hTERT mRNA的表达水平,CCK-8法绘制生长曲线检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况。使用DNAMAN软件比对分析人、马、小鼠、牛、绵羊、猪多物种TERT核苷酸、蛋白和端粒酶RNA组分(TERC)序列相似性。【结果】原代EFFs在实验室培养体系下可传至17代,但第17代细胞发生了衰老。hTERT基因可成功转入EFFs,并至少稳定表达20代。然而hTERT-EFFs增殖能力显著低于EFFs(P<0.05),hTERT-EFFs凋亡早期细胞率显著高于EFFs(P<0.05)。细胞衰老检测结果表明,hTERT-EFFs... 相似文献
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Although research on dairy goat mammary gland have referred extensively to molecular mechanisms, research on lines of dairy goat mammary epithelial cells (MECs) are still rare. This paper sought to establish an immortal MEC line by stable transfection of human telomerase. MECs from a lactating (45 days post‐parturition) Xinong Saanen dairy goat were cultured purely and subsequently transfected with a plasmid carrying the sequence of human telomerase. Immortalized MECs by human telomerase (hT‐MECs) exhibited a typical cobblestone morphology and activity and expression levels of telomerase resembled that of MCF‐7 cells. hT‐MECs on passage 42 grew vigorously and ‘S’ sigmoid curves of growth were observed. Moreover, hT‐MECs maintained a normal chromosome modal number of 2n = 60, keratin 8 and epithelial membrane antigen (EMA) were evidently expressed, and beta‐casein protein was synthesized and secreted. Beta‐casein expression was enhanced by prolactin (P < 0.05). Lipid droplets were found in hT‐MECs, and messenger RNA levels of PPARG, SREBP, FASN, ACC and SCD in hT‐MECs (passage 40) were similar to MECs (passage 7). In conclusion, the obtained hT‐MEC line retained a normal morphology, growth characteristics, cytogenetics and secretory characteristics as primary MECs. Hence, it can be a representative model cell line, for molecular and functional analysis, of dairy goat MECs for an extended period of time. 相似文献
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为探讨鸡p15基因的生物学功能,试验构建了鸡p15基因的真核表达载体pcDNA3.1( )-p15,并转染到鸡MDV转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1,应用G418筛选掉未转染的细胞,对存活细胞p15蛋白的表达、细胞增殖力、群体倍增时间、细胞周期和端粒酶的活性进行了检测。结果表明,与转染空质粒pcDNA3.1( )细胞相比,转染了p15基因的细胞稳定表达了p15蛋白;细胞的增殖受到了抑制,抑制率达45%～74%;群体倍增时间从27h延长至416h;流式细胞仪分析细胞周期发现,p15蛋白引起了细胞多停滞于G0/G1期,S和G2/M期细胞比例下降;端粒酶活性受到抑制。 相似文献
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为了探究黄藤素的体外细胞毒性,采用不同浓度的黄藤素作用山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）后,采用MTT法绘制细胞生长曲线;倒置显微镜下观察细胞生长状态;瑞氏-姬姆萨染色法观察细胞形态学变化并通过测定乳酸脱氢酶（LDH）含量检测细胞膜的完整性。结果显示,当黄藤素的浓度为10~227 μg/mL时,黄藤素对EECs有促增殖的作用;当浓度大于227 μg/mL时出现细胞增殖抑制现象,药物对细胞的半数增殖抑制率（IC50）为360 μg/mL;瑞氏-姬姆萨染色结果显示,100、200 μg/mL的黄藤素作用于EECs时均未对其细胞核、细胞浆的形态产生影响;LDH结果显示,药物浓度≥250 μg/mL时细胞LDH的释放量极显著高于正常细胞组（P<0.01）。综上所述,黄藤素作用于山羊EECs后呈现一定的毒性作用,且呈现显著的剂量依赖效应,作用于EECs的安全剂量范围为≤250 μg/mL。 相似文献
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YAN Bao-qi DONG Shu-wei WANG Dong-sheng NA Li-dong SANG Meng-qi YANG Hong-zao ZHANG Shi-dong YAN Zuo-ting 《中国畜牧兽医》2016,43(12):3239-3244
To explore the cytotoxicity of palmatine in vitro,goat endometrial epithelial cells (EECs) were stimulated by different concentrations of palmatine,then the growth curve of cell was drew by MTT assay which could detect the cell proliferation. The cell growth state was observed by inverted microscope,and Wright-Giemsa staining was used to observe morphological changes of the cells while LDH test was used to check the membrane permeability of EECs. The results showed that when the concentration was 10 to 227 μg/mL,palmatine had a role in promoting proliferation of the EECs,while when the concentration was more than 227 μg/mL,cell proliferation was inhibited,and 50% inhibitory rate of proliferation (IC50) of this drug on EECs was 360 μg/mL.Wright-Giemsa staining results showed that themorphology of the nucleus and cytolymph were not significantly changed when 100 and 200 μg/mL palmatine effected EECs. LDH results showed that when the palmatine concentration was more than 250 μg/mL,LDH content was extremely significantly higher than that of normal cell group(P<0.01).In conclusion,palmatine presented certain toxic effect on EECs with a significant dose-response effect,and the safe dose range of palmatine was less than 250 μg/mL. 相似文献