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1.
牛抗菌肽Bac7-Bac5-β defense串联基因在昆虫杆状病毒系统中的表达及其产物的活性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank中公布的牛抗菌肽bac7、bat5和βdefense(LAP基因)成熟肽基因序列,人工合成了抗菌肽融合基因Bac7-BacS-β defense,克隆到BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFAST HTb载体中,构建了重组转座载体pFASTBac-Bac7-Bac5-βdefense,转化DH10Bac大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞,PCR方法筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-Bac7-Bac5-βdefense,转染昆虫草地夜蛾(Bombyx mandarina)Sf9细胞出现病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾St9单层细胞,收集Si9细胞超声破碎,12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见表达的融合蛋白带,分子量大小为20 kD,表达量约占细胞总蛋白的10.6%.体外抑菌实验表明重组的rBac7-Bac5-βdefense蛋白对大肠杆菌,具有抑菌活性. 相似文献
2.
根据Gen bank中公布的牛抗菌肽bac7、bac5和防御素（LAP）成熟肽基因序列,人工合成了抗菌肽融合基因Bac7-Bac5-β,克隆到BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFAST HTb载体中,构建了重组转座载体pFASTBac-B7-B5-β,转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,PCR方法筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-B7-B5-B,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞出现病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞,收集Sf9细胞超声破碎,12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见表达的融合蛋白带,分子量大小为20kD,与预测大小相符,表达量约占细胞总蛋白的10.6％。体外抑菌实验表明重组的rB7-B5-B蛋白对大肠杆菌具有抑菌活性,本研究为新型抗菌制剂的研制和开发奠定了基础。 相似文献
3.
本研究克隆了广西沼泽型水牛γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)基因,并构建了水牛IFN-γ原核表达质粒。从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导培养13 h后,提取细胞总RNA,用水牛IFN-γ基因特异性引物通过RT-PCR扩增水牛IFN-γ成熟肽编码区cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中。RT-PCR产物电泳可见约457 bp大小目的片段。经过限制性酶切分析,测序证实克隆得到的基因序列正确。将IFN-γ成熟肽编码区基因片段切下亚克隆到表达载体pET-32a 中,构建成重组表达质粒pET-mIFN-γ。PCR、双酶切电泳和序列测定结果均证实已插入约457 bp的IFN-γ基因片段。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,水牛IFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高效的表达,融合蛋白的分子量为35 ku,表达量占菌体总蛋白的43.6%。 相似文献
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棉铃虫核型多角体病毒（HaSNPV）ORF27编码区全长768bp，编码255个氨基酸残基组成的多肽，预计分子量29.5kD。PCR扩增获得该基因，克隆到融合表达载体pGEX-4t-2中，表达蛋白分子量55.5kD，表达量约占细菌总蛋白的9.2%。割胶透析法纯化融合蛋白，免疫家兔制备多克隆抗体。再把该基因插入到转移载体pFastBacHTb，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，构建重组病毒；提取病毒基因组DNA，在Lipofectin介导下转染昆虫细胞Tn-5B1-4。表达蛋白分子量为32kD，表达量约占细胞总蛋白的2.9%。将ORF27在昆虫细胞中表达产物固定，免疫电镜法确定表达蛋白主要存在于细胞的细胞质中。ORF27基因表达及在细胞内定位为其进一步研究提供了基础。 相似文献
5.
猪生殖和呼吸综合征病毒中国分离株B13株ORF5基因在杆状病毒系统中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究将PRRSV B13株ORF5基因克隆到杆状病毒转移载体质粒pVL1393中,构建了重组转移载体质粒pVL1393-ORF5.用该重组转移载体质粒与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV-SVI-G)基因组DNA(BaculoGold Linearized Baculovirus DNA)共转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda,sf9)细胞,得到重组病毒AcMNPV-OCC-- ORF5 .在感染了重组病毒的sf9细胞中成功地检测到分子量为25kD的ORF5基因表达产物,其能被猪抗PRRSV B13株多克隆血清特异识别.表明sf9细胞表达了所期望的产物,进而也说明基因片段的正确性.猪抗PRRSV VR-2332株多克隆血清对ORF5基因的表达产物无反应,而猪抗LV株多克隆血清则能特异识别,说明PRRSV中国分离株B13株在抗原性上更接近欧洲亚群分离株LV株的抗原性,进一步证实了PRRSV中国分离株B13株属于欧洲亚群.ORF5基因表达产物与天然蛋白分子量十分接近,说明杆状病毒表达系统能较适当的进行合成蛋白的加工和修饰.本研究的结果为PRRS基因工程疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
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蜂毒溶血肽（melittin）的cDNA克隆 总被引：6，自引：2，他引：6
本项研究从处于活跃表达蜂毒溶血肽时期的蜜蜂蜂王毒腺中提取了总ＲＮＡ，经生物素标记的多层纤维素亲和层析，分离出蜂毒溶血肽的ｍＲＮＡ，再经ｍＲＮＡ－ｃＤＮＡ反转录，合成了蜂毒溶血肽的ｃＤＮＡ，并将其克隆到了表达载体λｇｔ１１上，建立了ｃＤＮＡ文库；经对重组噬菌斑显以筛选和对蜂毒溶血太基因的ＰＣＲ检测及对产物的免疫检测，证明蜂毒溶血肽的ｃＤＮＡ克隆成功，得到十二个了性反应的克隆。 相似文献
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苹果酸-乳酸酶是进行MLF的关键酶.该研究以酒类酒球菌31DH(Oenococcus oeni 31DH)的基因组DNA为模板进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA的PCR扩增.PCR引物为5'-CGGAATTCATGACAGATC-CAGTAAGTAT-3'和5'-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT-3',引物的5端分别引入EcoRI和KpnI酶切位点.得到的PCR产物约1.6kb.PCR产物回收后用EcoRI-KpnI双酶切,与经同样双酶切的质粒YEp352(大肠杆菌-酵母穿梭载体)进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞,筛选重组质粒并用酶切及PCR验证.获得的酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒命名为pLmleA. 相似文献
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山羊痘病毒P32基因跨膜区缺失载体的构建与表达* 总被引：2，自引：0，他引：2
P32基因是山羊痘病毒的主要免疫原性基因,含有跨膜区,用一般的诱导方法进行诱导表达,表达量较低。本文尝试用重组PCR消除跨膜区,连接入pGEX-6P-1载体,构建pGEX-6p-s重组表达载体,再用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE结果发现,在58KDa处检测到蛋白,与预期目的蛋白位置相符,用山羊痘标准阳性对表达产物进行Western检测,表达产物可被山羊痘标准阳性血清识别。表达产物以融合蛋白的形式存在,融合蛋白出现在沉淀中,以包涵体的形式存在,用Bandscan软件对所表达的蛋白进行分析发现,表达产物约占菌体蛋白的29.4%。 相似文献
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水牛α-干扰素基因的克隆与表达及其抗病毒活性 总被引：7，自引：2，他引：7
从福安和富钟水牛(water buffalo，WB)基因组中克隆了其α-干扰素基因Fa-WBIFN-α,和Fz—WBIFN-α,，并分别与pQE30表达载体连接、测序后用IPTG诱导表达。结果表明，水牛IFN—α基因全长498个核苷酸，编码166个氨基酸的成熟蛋白，与已报道的牛α-干扰素(BoIFN—α)8个亚型氨基酸序列同源性为91．6％～94．2％，均为BoIFN—α的新亚型。SDS-PAGE和Western blot分析表明，表达产物分子量约为20kD，表达量占菌体总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在。经包涵体提取、尿素变性和复性后，重组水牛α-干扰素(rWBIFN—α)在CEF／VSV和MDBK／VSV细胞系上的活性分别为10^5U／mg和10^6U／mg。并且，rWBIFN-α对传染性牛鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus IBRV)感染有抑制作用。 相似文献
10.
PCR扩增获得水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)叶绿体Rubisco SSU引导肽基因和水稻条纹病毒(Rice stripe virusRSV)外壳蛋白(coat protein,CP)基因.分别借助于pGEX-4T-1和pET-29a表达载体,通过两种方法构建了融合基因PR-CP和PR-S-CP.测序表明,其读码框完整,连接部位正确.将重组子pGEX-PR-CP和pET-PR-S-CP转化大肠杆菌(Eschetichia coli)BL21(DE3)并诱导表达.SDS-PAGE电泳检测其表达产物分子量分别为64和40 kD,与预期结果大小一致.Western blot鉴定发现.两种融合基因的表达产物均能与RSVCP抗体特异结合,说明融合蛋白中RSVCP蛋白保持了自身的抗原活性,叶绿体Rubisco SSU引导肽并未影响其正确表达.可以推断两种融合基因PR-CP和PR-S-CP在生物体内表达时,融合蛋白中的Rubisco SSU引导肽和RSV CP蛋白可能都能保持各自独立的结构和功能. 相似文献
11.
海洋双RNA病毒(Marinebirnavirus,MABV)可引起多种海洋鱼贝的腹水病等病症。利用RT-PCR技术得到了MABVY-6株系A片段的cDNA,进而克隆了病毒的外壳蛋白VP2e的抗原决定簇区642bp片段(vp2e)和另一结构蛋白VP3编码区序列。通过转座作用构建了重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中对VP2e和VP3进行了表达。SDS-PAGE检测和薄层扫描表明,VP2e和VP3与增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)融合蛋白表达量分别占整个昆虫细胞蛋白的15.8%和8.2%。用HisTag单抗和MABV病毒多抗对表达的VP2e融合蛋白进行Westernblot检测,结果表明表达产物具有很好的抗原性。同样,用HisTag单抗和VP3多抗对表达的VP3融合蛋白进行的Westernblot检测,证明融合蛋白表达正确,并且表达产物可溶,易于纯化。实验结果为该病毒结构蛋白和MABV疫苗研究提供了基础。 相似文献
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本研究利用PCR方法扩增出Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠhexon基因主要抗原区,连接于表达载体pGEX-4T-1中,构建成重组质粒pGEX-hexon,并转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的Hexon蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,试验成功扩增获得hexon基因主要抗原区序列,大小为1020bp。重组蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白大小为63.1ku,与预测值相符。经Western-blot分析,表明重组蛋白与FAVⅠ的阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础。 相似文献
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摘要: 用限制性内切酶酶切的方法把人工合成的GFM cry11B基因编码区克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中，构建成重组表达质粒pGC。在大肠杆菌(Escherichia coli )中表达了GST-GFMCry11B融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的21%，其表达产物主要以包涵体的形式存在。对包涵体蛋白进行可溶性处理，用Glutathione Sephrose 4B纯化出GST-Cry11B融合蛋白。Thrombin酶切后得到Cry11B蛋白，将其作为抗原免疫家兔获得了滴度（ELISA）为1∶8000的抗血清，并具有较强的特异性。 相似文献
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33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒（fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ）的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。 相似文献
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猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF)基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过RT-PCR方法,从经ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）编码区的cDNA并将其克隆至pMD-19T载体,序列测定表明pGM-CSF基因的长度为435 bp,编码144个氨基酸。通过PCR方法获得缺失其N端17个氨基酸残基信号肽序列的成熟pGM-CSF蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达质粒pET-GM并转入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21（DE3）中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白分子量约31 kD,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的30.4% 。采用Ni2+-NTA亲和层析柱对经稀释复性的重组蛋白进行纯化,并采用MTT法以TF-1细胞检测纯化产物的生物学活性。结果表明,重组蛋白可有效刺激TF-1细胞增殖,其活性达到3.43×105 IU/mg。 相似文献
16.
摘要：GP41是杆状病毒包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virus，ODV）特有的糖蛋白，它介导芽殖型病毒粒子（Budded virus，BV）的核衣壳通过胞核。用PCR方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedro virus，SpltMNPV）gp41基因, 并将其克隆至5′端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上，转化大肠杆菌(Escherichia coli )M15[pREP4]，在1 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的1个37.9 kD融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔制备了特异的抗GP41抗体。Western印迹分析表明，该抗体适合进一步分析SpltMNPV GP41蛋白。 相似文献
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重组海参溶菌酶C端基因(SjLys-C)的可溶性表达和抑菌活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为进一步研究海参(Stichopus japonicus)溶菌酶基因(Sjys)(Genbank登录号:EF036468)中不司片段表达产物的生物特性,本研究通过对其cDNA片段的分析,发现C端基因区域所对应的蛋白质序列中含有非酶活性.根据已知的海参溶菌酶的cDNA序列,设计山含有Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的特异性引物,从新鲜的海参肠中提取总RNA,以其为模板利用RT-PCR扩增出长度为259 bp的溶菌酶C端(SjLys-C)基因.将该目的基因连接到pET-32a(+)载体上,构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-C,再转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组蛋白SjLys-C的基因工程菌.利用该工程菌诱导发酵,结果显示它能高效表达出26 kD左右的重组蚩白SjLys-C.经过Western blot分析,该重组蛋白在26 kD左右能够与Penta-His抗体发生特异性免疫反应.对纯化的重组蛋白SjLys-C进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和副溶血弧菌(Vibrio parahae molytic us)有较高的抑菌活性.此外,将该重组蛋白经100℃、40 min处理后,其抑菌能力提高了5％～21％.研究结果表明,重组蛋白SjLys-C基因工程菌能够制备出具有可溶性的、并具有抑菌活性的重组蛋白SjLys-C,在农业和医药等行业中有潜在应用和开发价值. 相似文献
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摘要：本实验从质粒pGEM-HA中扩增H5N1亚型禽流感病毒HA基因，构建转移载体pFastBacHT-HA并与E.coliDH10Bac中的Bacmid质粒重组，构建重组转座质粒rBacmid-HA。在脂质体介导下将rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达HA蛋白，通过SDS-PAGE、Western blot和血细胞吸附实验鉴定重组蛋白。结果显示重组HA蛋白分子量约为66kDa，该蛋白与AIV H5亚型鸡血清发生特异性反应，与H7、H9亚型鸡血清不反应，转染重组杆状病毒后的细胞能吸附鸡的红血球，证明HA基因在sf9昆虫细胞中获得了正确表达，不仅具有型特异性，而且有良好的生物反应性。 相似文献
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植物激活蛋白Ap36在苏云金芽胞杆菌的表达及抗病作用 总被引：1，自引：0，他引：1
以含有植物激活蛋白(Activator protein)基因ap36的质粒pMYE为摸板,设计一对特异引物,通过PCR反应扩增出激活蛋白基因开放读码框序列,使用XbaI和SphI双切PCR产物,插入到用这两酶双切的pBMB982-304质粒slh motif的下游,构建重组表达质粒pBMB0588,转化苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171。结果表明,目标蛋白以融合蛋白的形式成功表达。为探讨表达植物激活蛋白的重组菌是否能够诱导植物获得抗性,用重组菌在28℃培养24小时发酵液原液处理番茄幼苗和土豆片。结果显示,发酵液处理90min后,番茄叶片过氧化物酶(POD)和脯氨酸含量较对照分别提高了57.14%和131.59%;4d后苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量较对照也有所提高;经重组菌发酵液处理的马铃薯片,对马铃薯软腐病表现出很强的抗病性。 相似文献