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1.
多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。 相似文献
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Risk Assessment of Synergism and Recombination on the Transgenic Plants Containing Viral Movement Protein and Replicase Genes 总被引：2，自引：0，他引：2
The transgenic tobacco plants transformed with movement protein gene of Tomato mosaic virus (ToMV) or Tobacco mosaic virus (TMV) and partial replicase gene of Cucumber mosaic virus (CMV) P1 isolate (CMV-P1), were inoculated with Potato virus X, Potato virus Y, TMV and CMV isolate RB (CMVRB), respectively. Symptom observation showed there were no symptom differences in transgenic tobacco plants as compared with those in non-transgenic tobacco plants. ELISA also illustrated that the virus concentrations in the transgenic plants were similar to those in non-transgenic plants, indicating that no synergism is found in these plants. The transgenic tobacco plants expressing movement protein gene of ToMV or partial replicase gene of CMV-P1 were inoculated with TMV and CMV-RB, respectively. The local or systemic infected leaves were then used for elucidation of the possible virus recombination in transgenic plants with biological infectivity test, ELISA and immuno-capture RT-PCR. Within 16 months, no recombination was found between transformed genes and inoculated virus genomes. The research provides fundamental data for understanding of the possible risk of the transgenic plants expressing viral sequences. 相似文献
3.
转病毒移动蛋白及复制酶基因烟草的协生和重组风险分析 总被引：2，自引：0，他引：2
对转化番茄花叶病毒 (ToMV)、烟草花叶病毒 (TMV)移动蛋白 (MP)基因和黄瓜花叶病毒P1株系(CMV P1)部分复制酶基因的 3种转基因烟草 ,分别接种马铃薯X病毒 (PVX)、马铃薯Y病毒 (PVY)、CMVRB株系 (CMV RB)和TMV。症状观察和ELISA测定发现 ,各病毒在转基因烟草和非转基因烟草上的症状及病毒浓度没有显著差异 ,表明这些病毒在转基因烟草上没有协生作用发生。对转化ToMVMP基因和转化CMV P1部分复制酶基因的转基因烟草 ,分别接种TMV和CMV RB ,定期进行生物学、ELISA和免疫捕获反转录PCR(IC RT PCR)检测 ,在 16个月的连续测定中未发现病毒重组现象。 相似文献
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转烟草花叶病毒复制酶基因烟草的病毒抗性研究 总被引：2，自引：0，他引：2
对用根瘤农杆菌双质粒法导入烟草花叶病毒复制酶基因的转基因烟草后代的研究表明：转基因烟草抗烟草花叶病毒和马铃薯Ｘ病毒,但感染马铃薯Ｙ病毒,抗病毒的转基因烟草存在某种机制限制着病毒在植株内的转移,转烟草花叶病毒复制酶基因烟草植株内不产生该复制酶,其抗病毒的确切机制有等进一步研究。 相似文献
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PtWRKY14 是从毛白杨中获得的WRKY 基因,为研究PtWRKY14 基因对植物抗病性的影响,构建了毛
白杨PtWRKY14 基因的植物表达载体pBI121-W14,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,PCR 与Southern 杂交
进行转基因烟草鉴定。对获得的转基因烟草植株进行烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV）的接种试验,结果表
明PtWRKY14 基因的转化使烟草对TMV 的抗性增强。荧光定量PCR 检测结果表明,TMV 接种后,转基因烟草中
PtWRKY14 的表达量显著上调,同时转基因烟草中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD）、过氧化物酶(Peroxidase,POD）、过氧化氢酶(Catalase,CAT）的表达量均高于对照组。因此,PtWRKY14 可能通过上调SOD、POD、
CAT 的表达从而增强植物抗病性。 相似文献
6.
The proposed role of the 30-kilodalton(kD) protein of tobacco mosaic virus is to facilitate cell-to-cell spread of the virus-during infection. To directly define the function of the protein, a chimeric gene containing a cloned complementary DNA of the 30-kD protein gene was introduced into tobacco cells via a Ti plasmid-mediated transformation system of Agrobacterium tumefaciens. Transgenic plants regenerated from transformed tobacco cells expressed the 30-kD protein messenger RNA and accumulated 30-kD protein. Seedlings expressing the 30-kD protein gene complemented the Lsl mutant of TMV, a mutant that is temperature-sensitive in cell-to-cell movement. In addition, enhanced movement of the Lsl virus at the permissive temperature was detected in seedlings that express the 30-kD protein gene. These results conclusively demonstrate that the 30-kD protein of tobacco mosaic virus potentiates the movement of the virus from cell to cell. 相似文献
7.
发根农杆菌介导的抗病毒基因导入番茄转化系统的建立 总被引：6，自引：1，他引：5
试验设置基因型、菌液浓度、外植体和方法 4个因素 ,利用发根农杆菌将抗 TMV (烟草花叶病毒 )的 TMV- CP基因和抗 CMV (黄瓜花叶病毒 )的 CMV- CP基因按 L16( 4 4× 2 3)正交表转化番茄。 Km抗性愈伤组织频率的结果表明 ,不同品种、不同菌液浓度转化频率存在着显著性差异 ,而外值体部位、方法之间差异不显著。并已得到 9株转化再生的番茄植株 ,经 PCR检测和EL ISA检测证明 TMV- CP和 CMV- CP基因已导入番茄并表达 相似文献
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动物α干扰素具有高效广谱的抗病毒作用,通过农杆菌介导法将35S驱动的干扰素基因ChIFN-α转化烟草,Southern杂交和Western杂交进行目的基因的转化、表达检测,重组蛋白的数量通过ELISA测定,对获得的转基因烟草植株进行TMV接种实验,结果表明ChIFN-α基因的转化赋予了转基因烟草对TMV的抗性,进一步的荧光定量PCR差异表达检测结果表明,该抗性可能与转基因烟草体内防卫基因PR-la、抗病N基因和信号转导MAPK基因受到上调表达有关。 相似文献
10.
高效靶向降解烟草花叶病毒核酸的dsRNA筛选与大量制备 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】筛选高效靶向降解烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的dsRNA,实现其大量制备,并探究其作用机制。【方法】以TMV编码的CP、MP、RdRP功能基因为靶序列,体外转录合成相应的dsRNA,浸润本氏烟（Nicotiana benthamiana）,24 h后接种TMV,于接毒后2、3 d取样提取总RNA和蛋白质,以CP基因mRNA水平和蛋白水平为指标,结合TMV病毒生物学症状,综合评价各dsRNA对TMV的抑制效果。同时结合侵染性克隆TMV-30B在本氏烟烟株上的荧光表达现象和TMV在三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）上的过敏性坏死反应（hypersensitive necrosis reaction）,通过比较TMV基因组上6个靶序列相对应的dsRNA,筛选出高效抑制TMV的dsRNA片段。为了获取大量的dsRNA,将dsRNA对应的基因片段插入到原核表达载体L4440的双T7启动子之间,转化至RNase III缺陷型大肠杆菌（Escherichia coli）HT115（DE3）中,并对原核表达制备的dsRNA喷施烟草后生成的siRNA进行深度测序,比较外源施用dsRNA后,对TMV侵染的small RNA表达特征和富集带的影响。【结果】筛选出高效影响TMV CP基因表达的dsRNA RdRP1461-1774,并构建了可诱导形成目的dsRNA的原核表达载体L4440-dsRdRP1461-1774,可在DE3中大量制备RdRP1461-1774的dsRNA,菌液中提取的dsRNA喷施于烟草上对TMV的防治效果显著。TMV-30B侵染本氏烟时荧光数量减少,并能够延长叶片萎蔫时间,在三生烟上施用时叶片枯斑数量明显减少。小RNA测序结果显示TMV侵染引起的RNAi过程中正义链和反义链以大致相等的频率产生siRNA,而外源性dsRNA的浸润会引起靶向区域siRNA的富集,siRNA反义链累积量骤增,对应的正义链累积量骤减,外源dsRNA的施用能够引起siRNA表达丰度的变化。【结论】通过比较dsRNA介导植物靶向抗TMV侵染的效果来筛选抗烟草花叶病毒的dsRNA序列,最终选定TMV RdRP基因上一段长313 bp的高效作用片段,该片段dsRNA能够高效与靶基因结合,降低染病植株烟草花叶病毒的表达量。同时构建了RdRP1461-1774基因的dsRNA原核表达系统,实现其低成本的高效量产,为后续dsRNA在植物病毒方面的防治应用打下了基础。 相似文献
11.
番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究 总被引：3，自引：1，他引：3
在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。 相似文献
12.
植物诱导抗病剂组合应用对烟草花叶病的防控效果 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]探讨植物诱导抗病剂组合对烟草花叶病的防控效果。[方法]在模拟病圃环境下,研究了6种植物诱导抗病剂的不同组合对烤烟栽培品种红花大金元的烟草花叶病的防控效果。[结果]多肽保与AHO 2种诱导剂的组合应用对控制TMV有良好效果,能明显推迟带毒隐症烟株TMV的发病时间,移栽后70 d对以清水和东旺毒消为对照的大田期烟株TMV的平均防效分别达到69.64%和43.25%,且在株高、叶数方面表现出明显优势,叶片生长发育状况良好。烟苗携带TMV病毒与症状能否表现无直接相关性,带毒隐症烟苗只有在发病条件适宜时才会表现症状。带毒隐症烟苗栽后19 d内是TMV发病的高峰期,在育苗阶段与大田期施用有效药剂,以及移栽后促进烟苗早生快发是控制其发病的关键措施。[结论]为制定烟草花叶病的防控措施提供了理论依据。 相似文献
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利用色氨酸单加氧酶基因iaaM与拟南芥表皮毛特异表达GL2基因启动子重组后,构建了在植物表皮毛细胞中特异表达iaaM基因的重组基因载体;采用根癌农杆菌叶盘转化法将重组基因转化到烟草WS38(对照)中,筛选和鉴定出了6株转化烟草植株;将该重组基因以根癌农杆菌花序浸渍法转至拟南芥(Colombia ecotype,对照),筛选出9株拟南芥转化植株,并对稳定转化的转基因植株表皮毛进行观察。结果表明:转基因烟草表皮毛较对照植株显著增长,其长度最长为对照的2.2倍,但转基因拟南芥表皮毛长度与对照间无显著差异。对烟草幼叶进行生长素浓度检测,转iaaM基因烟草吲哚乙酸含量显著提高,说明iaaM在烟草表皮毛细胞中表达,使其合成和积累更多的生长素;转基因拟南芥和烟草表皮毛密度均较对照显著增加,证明植物表皮毛发育模式中GL2表达的特异性受细胞内生长素的影响。 相似文献
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[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础. 相似文献
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根据烟草花叶病毒蚕豆株系（TMV-B）的已知序列合成引物，经PCR扩增获得TMV-B的移动蛋白（MP）基因。该基因测序验证后，分别以正、反向克隆到植物表达载体pBI121中，并置于CaMV35S启动子控制之下，通过三亲交配及叶盘转化，将MP基因导入烟草。经卡那霉素抗性筛选，PCR扩增，Southern点杂交,Northern点杂交及Westernblot检测，获得了正义表达MP基因及反义表达MP基因的转基因烟草，分别命名为pTMP（+）烟草和pTMP（-）烟草。 相似文献
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以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。 相似文献
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【目的】针对常规回交育种周期较长的问题,以烟草为模式植物,探索快速回交改良作物的有效方法。【方法】以对TMV免疫的烤烟品种Fc8作为抗性供体亲本,以综合性状优良但感TMV的中烟100为受体亲本进行回交改良及种质创新。首先从拟南芥中克隆早花FT,将其连接到植物表达载体P22上,并转入农杆菌中,采用叶盘法转化烟草Fc8,创建含FT的Fc8阳性植株。阳性植株分别与中烟100杂交,根据F1后代群体中早花基因的分离比例,鉴定筛选含单拷贝FT的阳性植株。接下来,从含单拷贝FT的阳性植株的F1群体中选择早花植株,与中烟100回交,根据回交分离群体中FT早花基因与TMV抗性N基因的分离比例,筛选FT与N基因不连锁的阳性植株。选择该阳性植株与中烟100连续回交。在每一回交分离世代中,选择早花且含有TMV抗性标记的植株连续回交,当后代遗传背景大部分与中烟100相近,并保留TMV抗性时选择非早花且含N基因标记的植株,鉴定无FT、Ubi启动子、Nos终止子和Hyg筛选标记等转基因元件后,连续自交纯化,筛选改良的创新种质。【结果】通过转基因技术共获得8株含FT的Fc8阳性植株,经鉴定获得一个含单拷贝FT,且FT和TMV抗性N基因不连锁的Fc8植株。用该植株作为TMV抗性的供体亲本回交改良中烟100,一年多时间已回交加代到BC4F1,比常规回交育种时间缩短450-500 d。早花基因在杂交、回交各世代均能稳定表达,早花植株在苗龄50-60 d现蕾开花,早花植株现蕾开花时,一般有3-4片叶,株高平均约35 cm,同期非早花植株高约27 cm,仍然处于营养生长阶段。非早花植株在苗龄130-140 d现蕾开花,平均株高约120 cm,叶片数18-20片。FT能使植株花期提前70-90 d,缩短世代周期约一半时间;早花加代结合TMV分子标记筛选得到了BC1、BC2、BC3代TMV抗性烟草新种质。【结论】借助FT介导的早花及抗TMV基因分子标记,能有效地缩短烟草TMV抗性回交育种周期、加快回交育种进程,虽利用转基因技术但可获得不含有任何转基因元件的创新种质。 相似文献
18.
以抗病毒植物苋色藜为材料,克隆拟南芥NDR1的同源基因,确定其亚细胞定位及该基因表达和抗病毒特性分析,为转基因抗病育种奠定技术基础。根据苋色藜转录组测序分析结果,采用RT\|PCR克隆获得两个与拟南芥同源的NDR1基因,分别命名为CaNDR1a和CaNDR1b,并通过实时定量PCR分析病毒侵染后基因的表达情况;构建植物瞬时表达载体,发现CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜;构建CaNDR1a和CaNDR1b植物表达载体,遗传转化获得转基因烟草,经酶联免疫吸附测定（ELISA）分析T1代植株对烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性。生物信息学分析揭示CaNDR1a和CaNDR1b是NDR1的同源基因。CaNDR1a和CaNDR1b在苋色藜接种TMV和CMV后显著上调表达。CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜上,并且病毒对CaNDR1a和CaNDR1b的胞内定位没有影响。ELISA结果显示部分转基因株系对TMV和CMV的抗性增加。初步表明CaNDR1a和CaNDR1b是拟南芥NDR1的功能性同源基因,参与植物对病毒的内源免疫反应。 相似文献
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[目的]探讨转截短hpalXoo基因烟草中与抗病性有关的5种防御酶系的活性变化.[方法]以转截短hpalXoo基因烟草A6-1和对应的非转基因烟草Xanthi叶片为材料,接种烟草花叶病毒（TMV）,测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性.[结果]未接TMV时,转截短hpalXoo基因烟草中POD、PPO和CAT酶活性均高于未转基因对照品种,而SOD和PAL活性与未转基因烟草无显著差异.接种TMV后,转截短hpalXoo基因烟草中5种防御酶活性均显著增加,且高于未转基因烟草,并维持在一个较高的水平.[结论]截短的hpalXoo基因在烟草中表达能显著提高其抗病防御酶活性水平. 相似文献
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毛白杨TIR-NBS-LRR基因转化烟草的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
该文采用农杆菌介导法将从毛白杨中克隆得到的TIR-NBS-LRR抗病基因（PtDRG01）导入烟草中,经抗生素筛选和PCR分子检测,获得了一批阳性转化植株。进而对这些阳性转化植株进行烟草花叶病毒接种实验,从表型观察结果发现,在接种病毒1周和6周后,转基因烟草株系TG-11的发病程度明显低于非转基因烟草。荧光定量分析结果显示,转基因烟草株系TG-11叶片中的烟草花叶病毒(TMV)数量显著低于非转基因植株,且该转基因株系中的PtDRG01基因转录水平显著高于非转基因植株。这些结果表明,毛白杨PtDRG01基因具有明显的抗病功能,其高效表达能够显著提高烟草的抗TMV能力。该文通过对烟草的遗传转化与病毒接种实验,鉴定了PtDRG01基因的功能,可为其他TIR-NBS-LRR基因的功能鉴定提供参考。 相似文献