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利用抗体法（picoBlueTMImmunscreening Kit,应用B.gibsoni感染血清）从犬吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni）裂殖子mRNA制备的吉氏巴贝斯虫cDNA文库中进行免疫筛选,选出目的基因相cDNA片段（阳性克隆）.测序验证后将该cDNA（基因）克隆至原核表达载体pGEX-4T-3,构建重组质粒,在大肠杆菌E.coli（DH5a）中以GST融合蛋白的形式表达（SDS-PAGE分析证明）;表达产物为130kDa的可溶性融合蛋白.免疫学分析（Western blot和ELISA）结果表明,犬吉氏巴贝斯虫重组GST-P130kDa融合蛋白（rBg GST-P130kDa）能与犬吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni）感染血清起反应,且与犬巴贝斯虫（B.canis）无交叉反应.本试验利用犬吉氏巴贝斯虫重组BgGST-P130kDa融合蛋白（作为重组抗原）检测巴西（n=310）、日本（n=100）和中国（n=114,n=30）等国随机采集的自然感染狗血清,其结果为巴西狗血清阳性率为55%、日本为8%、中国为1～9%;其结果与间接荧光抗体法（IFAT）结果为一致（作为验证）.结果表明重组BgGST-P130kDa融合蛋白具有较强的免疫原性和特异性,可用于吉氏巴贝斯虫病的诊断,这为吉氏巴贝斯虫病的早期诊断和深入研究犬吉氏巴贝斯虫病的特异性重组抗原及重组疫苗奠定基础. 相似文献
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吉氏巴贝斯虫Bg TRAP蛋白是一个重要的诊断抗原候选分子。为建立一种实用的犬吉氏巴贝斯虫血清学诊断方法,本研究选取Bg TRAP C-末端跨膜区前,包含TSP功能区和抗原区的411个氨基酸的编码基因片段,重组表达了一个可溶性截短型Bg TRAP抗原,解决了完整蛋白重组表达纯化的困难。免疫荧光试验表明,截短型抗原具有良好的抗原性。纯化的截短型抗原作为酶联免疫试验诊断抗原,可清晰地区分阴性及阳性犬血清,并与其他病原感染无交叉反应,具有良好的特异性。犬感染吉氏巴贝斯虫系列血清检测表明,该抗原可检测早期感染(4 d)和感染200 d以后的样本。结果提示,重组Bg TRAP截短型抗原可作为一种诊断制剂检测犬吉氏巴贝斯虫抗体。 相似文献
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本研究利用简并引物首次从副猪嗜血杆菌基因组DNA中克隆获得全长HSP70基因(登录号:EU69-3116),基因测序结果表明HSP70完整阅读框1 908 bp,根据编码序列推导出相应635个氨基酸.经BLAST分析表明,其氨基酸序列与溶血性曼氏杆菌、杜克雷嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等同源性最高,达到90%左右.将HSP70部分基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,经酶切鉴定正确后转化感受态大肠杆菌BL21,以异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白.SDS-PAGE表明表达的重组蛋白约46 l(u,将表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清.Western blot结果显示该融合蛋白与副猪嗜血杆菌人工感染猪血清以及原核表达蛋白免疫的小鼠抗血清反应后有明显的特异性条带,证明该重组蛋白具有良好的抗原性,为HSP70功能研究奠定了重要基础. 相似文献
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为表达马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因,制备多克隆抗体,试验根据GenBank中马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成1对特异性引物,以提取的新疆株Bc48基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后表达产物进行SDS-PAGE分析,切胶纯化蛋白后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备多克隆抗体;同时把该基因克隆至真核表达载体pCMV-N-flag中,将阳性质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取pCMV-N-flag-Bc48质粒转染到293T细胞中进行真核表达。结果显示,获得了大小约为15ku的融合蛋白,与预期目的蛋白大小相一致;免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体经ELISA和Western blotting检测、验证,能特异地识别相应抗原,其抗体效价可达1∶128 000,说明该多克隆抗体有较高的抗体效价和特异性;真核表达质粒在293T细胞中表达Bc48蛋白。本试验可为进一步研究马驽巴贝斯虫功能基因及建立快速的检测方法奠定基础,在虫株的分类学研究及候选疫苗的研制中有重要意义。 相似文献
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为表达犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP蛋白及鉴定其抗原表位,本研究将犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP编码基因的密码子进行优化和高效表达,并利用生物学软件分析预测,结果显示,Bg TRAP中存在10个潜在的线性抗原表位,通过原核表达系统对其预测表位的多肽进行表达,以筛选的阳性血清样品为检测抗体进行ELISA检测,结果表明其中3个多肽能够与抗体特异性结合,其多肽序列分别为126DYVIAVEDTTHFGE139、672AYILAGFA GLLLIT685和497SDELGDEMGLTTNE510。本研究对Bg TRAP蛋白抗原表位的鉴定,为进一步开发基于Bg TRAP的犬吉氏巴贝斯虫诊断抗原及Bg TRAP的免疫学特性研究奠定了基础。 相似文献
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将含有山羊白细胞介素(gIL)-18基因的重组质粒pET-32a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中以1 mmol/L IPTG诱导4 h以上进行表达,SDS-PAGE试验检测到了gIL-18与pET载体融合表达的重组蛋白。以该重组蛋白与佐剂混合后,免疫小鼠制备多克隆抗血清,经Western blotting试验证实该重组蛋白具有免疫原性。经过包涵体变性、层析柱纯化和复性,证实该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性。这表明重组蛋白保留了天然蛋白大部分的生物学活性。另外发现,该重组蛋白还可以保护小鼠抵御PRV强毒的攻击。这为阐明重组gIL-18的活性以及作为免疫佐剂和免疫治疗剂的实际应用奠定了基础。 相似文献
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旨在检测患病犬经三氮脒治疗后,吉氏巴贝斯虫线粒体细胞色素b(Cyt b)是否存在基因突变。调查了2010至2020年犬巴贝斯虫病的流行情况,收集了11份自然感染吉氏巴贝斯虫且接受三氮脒治疗的患犬血液样品,采用蛋白酶K消化,苯酚提取法提取血液中基因组DNA,设计引物,通过PCR扩增吉氏巴贝斯虫Cyt b基因片段并进行测序分析。调查发现,自2010年以来,通过三氮脒治疗的吉氏巴贝斯虫病的疗程逐渐延长,复发率也逐渐增加。在11份血样中,吉氏巴贝斯虫的Cyt b基因彼此之间相似性高达99.65%～100%,与日本分离株也有较高的同源性(99.18%～99.54%)。在Cyt b基因nt363基因位点上没有发现基因突变。这些结果说明虽然吉氏巴贝斯虫对三氮脒逐渐产生耐药,但三氮脒对吉氏巴贝斯虫Cyt b基因并不产生影响。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2020,(3)
试验旨在获得高纯度犬降钙素原(procalcitonin,PCT)重组蛋白,并对该蛋白的临床应用进行分析。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将PCT基因克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,经双酶切和测序鉴定阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,采用镍柱进行重组蛋白的纯化,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测重组蛋白与犬PCT多克隆抗体的特异性,采用ELISA法检测健康犬和炎症犬血清PCT。双酶切及测序结果显示,犬PCT基因成功插入pET-30a(+),未出现碱基突变;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量为14.9 ku,间接ELISA法测定的免疫小鼠血清抗体效价达1∶51 200。Western blotting结果表明,制备的多抗血清具有很好的特异性;ELISA结果显示,炎症犬血清内检测到PCT,且其浓度与炎症反应程度呈正相关。结果表明,本研究成功制备了犬PCT蛋白多克隆抗体,且犬血清PCT蛋白是一种潜在的新型严重细菌性炎症感染指示物。 相似文献
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犬巴贝斯虫病是由巴贝斯虫(Babesia)引起的以硬蜱为媒介传播的血液原虫寄生虫病。引起该病的病原体有犬巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫和韦氏巴贝斯虫三种,在我国主要为前二种。笔者在南京农业大学动物医院实习期间多次见到犬巴贝斯虫病例,以下列举2例,分别为犬巴贝斯虫病和吉氏巴贝斯虫病。1病例介绍病例1:2011年3月22日,接诊1只3个多月大的狼犬,雌性,14.7 kg。1周前开始吃得少,精神差,少动,走路无力,小便黄。 相似文献
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《畜牧兽医科技信息》2017,(8)
正犬巴贝斯虫病是犬的一种血液寄生虫病,其病原体为巴贝斯虫或其他焦虫。临床上,本病主要表现为呼吸困难、高度贫血、黄疸、血红蛋白尿等特征。犬巴贝斯虫病在我国目前发病越来越多。1病原特征据报道,引起本病的病原主要有犬巴贝斯虫、吉氏巴贝斯虫及韦氏巴贝斯虫。犬巴贝斯虫和吉氏巴贝斯虫的感染在我国常见,但韦氏巴贝斯虫在我国尚未见报道。1.1犬巴贝斯虫犬巴贝斯虫寄生于犬的红细胞内。虫体为梨形,一端尖,另一端圆,内有一个空泡,典型虫体大于1/5红 相似文献
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为表达马驽巴贝斯虫新疆伊犁株Bc48基因,制备多克隆抗体,试验根据GenBank中马驽巴贝斯虫Bc48基因序列,设计合成1对特异性引物,以提取的新疆株Bc48基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a（+）中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导后表达产物进行SDS-PAGE分析,切胶纯化蛋白后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,制备多克隆抗体;同时把该基因克隆至真核表达载体pCMV-N-flag中,将阳性质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,提取pCMV-N-flag-Bc48质粒转染到293T细胞中进行真核表达。结果显示,获得了大小约为15 ku的融合蛋白,与预期目的蛋白大小相一致;免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体经ELISA和Western blotting检测、验证,能特异地识别相应抗原,其抗体效价可达1：128 000,说明该多克隆抗体有较高的抗体效价和特异性;真核表达质粒在293T细胞中表达Bc48蛋白。本试验可为进一步研究马驽巴贝斯虫功能基因及建立快速的检测方法奠定基础,在虫株的分类学研究及候选疫苗的研制中有重要意义。 相似文献
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《畜牧兽医科技信息》2017,(12)
<正>巴贝斯虫病是由巴贝斯科、巴贝斯属的梨形虫寄生于马、牛、羊、犬等家畜的红细胞内引起的血液原虫病。寄生于犬的虫种主要是犬巴贝斯虫和吉氏巴贝斯虫,犬吉氏巴贝斯虫病发生、流行于多个省区,是流行于我国的主要虫种。笔者对我校动物医院接诊的一例斗牛犬吉氏巴贝斯虫病的临床表现、病原学、血常规、血液生化、诊断与治疗过程进行分析,旨在提高对犬吉氏巴贝斯虫病的诊断与治疗水平。1材料与方法1.1病犬临床检查与治疗 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(4):668-670
选用健康本地杂种犬,分为2组,一组手术切除脾脏,另一组未经任何处理,然后2组犬人工静脉接种含犬吉氏巴贝斯虫的病犬血液,接种后观察临床症状、进行实验室检查(血涂片、血常规、病原的PCR检测),检测2组犬人工感染犬吉氏巴贝斯虫后的发病情况。结果显示,人工感染后2组犬均表现出自然感染犬吉氏巴贝斯虫后的临床症状,实验室检查血涂片中检测到犬吉氏巴贝斯虫虫体,血常规表现出严重的贫血,PCR能扩增出犬吉氏巴贝斯虫的基因片段。2组犬比较显示,切脾组的红细胞感染率和贫血程度均高于未切脾犬。本试验成功建立了犬吉氏巴贝斯虫人工感染方法,且脾切除后感染效果优于直接静脉感染。 相似文献