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喜树是中国传统的珍贵药用植物,因其含有抗癌、抗病毒药物喜树碱而被广泛关注。然而喜树碱在喜树中的低积累量限制了其在市场上的应用,因此喜树碱生物合成途径关键酶基因功能的鉴定及其代谢途径的解析变得尤为重要。稳定遗传转化因其周期长、效率低而无法快速鉴定相关基因,瞬时转化则具有高效、方便、易操作等特点。利用瞬时转化可望更快速地解析未知代谢途径,进而调控喜树碱的合成、提高喜树碱的含量。目前喜树中瞬时转化研究较少,并且在前期实验中发现,选取同时期不同个体的喜树叶片进行瞬时转化,会因生理生化差异导致实验数据误差较大,进而增加实验结果分析的难度。所以,建立一种降低个体差异的喜树叶片瞬时转化方法具有重要的理论价值和现实意义。本研究以转化p BI121GD(GUS DELETED)和p BI121(35S::GUS)的根瘤农杆菌GV3101分别侵染喜树同一叶片左右部分,在侵染后不同时期进行GUS染色以检测同一叶片的左右部分GUS蛋白的表达差异,并利用半定量RT-PCR来检测GUS基因的转录水平。结果表明:与对照组比较,在侵染后的第7天实验组中的GUS基因和GUS蛋白均有较高的表达。上述结果表明,成功的在喜树中建立了一种降低个体差异的喜树叶片瞬时转化方法。 相似文献
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喜树中抗肿瘤活性成分喜树碱的生物合成调控具有重要的理论意义与应用价值。基于喜树碱生物合成途径的复杂性及其积累的时间、空间特异性,本研究选择生理状态的均一的喜树悬浮细胞作为研究材料,分析植物激素茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, Me JA)、脱落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellin, GA)以及水杨酸(salicylic acid, SA)对喜树碱合成途径中关键酶基因转录水平的调控。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测结果显示,MeJA、ABA、GA以及SA均可促进喜树碱合成色胺途径中关键酶基因CaTDC1以及下游CaSTR的表达,且在处理2 h左右达到峰值;MeJA、GA、SA主要调控环烯醚萜途径中关键酶基因Ca7DLGT、CaG8O、CaCYC1的表达,而ABA则显著调控色胺途径关键酶基因CaTDC1以及下游CaSTR的转录水平;4种激素中SA调控效果与其他激素相比极其显著。本实验排除了喜树碱合成时间、空间特异性影响以及植物向重性、激素浓度梯度等干扰因素,准确地分析了4种激素对喜树碱合成途径关键酶基因的调控,为后续研究植物激素... 相似文献
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为了进一步研究Ta EF-1α基因在小麦响应干旱胁迫中的作用,首先在正常灌水和干旱胁迫2个处理下对Ta EF-1α基因在转录水平上的表达量进行了验证,并利用VIGS(Virus induced gene silencing)技术将Ta EF-1α基因进行沉默,对其功能进行研究。结果表明,Ta EF-1α基因在m RNA水平上的表达量与其蛋白水平上的变化趋势一致,均受干旱诱导上调表达。与正常灌水且未进行VIGS沉默处理的植株相比,干旱处理且未进行VIGS沉默处理的植株中Ta EF-1α基因表达量极显著升高,其叶片相对含水量也极显著降低、相对电导率和丙二醛(MDA)含量则极显著升高;干旱条件下,与未进行VIGS沉默的对照植株相比,VIGS沉默后的植株中Ta EF-1α基因表达量极显著下降,其叶片相对含水量也极显著降低、相对电导率和丙二醛(MDA)含量则极显著升高,植株表现出叶片下垂、对干旱胁迫敏感的表型。综合干旱处理和VIGS沉默Ta EF-1α基因后小麦植株的表型和生理指标变化,说明干旱胁迫诱导小麦植株中Ta EF-1α基因上调表达,敲低Ta EF-1α基因表达后小麦抗旱性显著下降,因此,Ta EF-1α基因在小麦响应干旱胁迫中可能发挥了重要作用。 相似文献
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多酚氧化酶（PPO）是发生酶促褐变的关键酶,PPO活性过高会使烟叶变褐。为明确烟草NtPPO8基因对PPO活性的影响,建立降低NtPPO8基因表达量的病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing,VIGS）体系,探究使用RNA干扰技术对烟叶NtPPO8基因表达量及PPO活性的影响。以中烟100和K326为材料,分析在移栽后50d进行VIGS载体侵染的植株,并在侵染后10、20、30、40d分别测定NtPPO8基因表达量及PPO活性。结果表明,接种VIGS载体的转化植株,其中在侵染后20d时NtPPO8基因的沉默效率最高,为78.46%;随着侵染时间推移,NtPPO8基因的沉默效率逐渐降低,在接种后40d内有效表达;且转化植株中的病毒载体会随着植株的生长而向上传导,随着接种部位的上移,沉默效率逐渐降低。因此,研究建立VIGS体系能够有效沉默NtPPO8基因的表达,并且有效降低PPO活性,为提高烟叶耐烤性及降低烟叶褐变比例提供了新的思路和方法。 相似文献
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为防止棉铃脱落提高结铃性,进而提高棉花产量,从陆地棉中分离出一个参与离层分化调控的相关基因GhBOP1。通过生物信息学分析,表明GhBOP1蛋白序列含有保守性强的BTB和ANK结构域;进化树分析显示该蛋白氨基酸序列与许多植物的同源蛋白相似程度很高,说明该类蛋白进化较慢。利用qRT-PCR进行组织特异性表达分析的结果表明,GhBOP1基因在根、茎、叶和花等组织器官中均有少量表达,但在离层中为优势表达,表达量为叶片表达水平的20倍。利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术干涉棉花GhBOP1基因的表达,同时进行低盐胁迫处理分析,对照植株叶片出现大量地脱落,而GhBOP1基因沉默植株叶片生长正常。总之GhBOP1基因在离层中优势表达,并对离层的形成可能具有调控功能。 相似文献
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构建真菌基因敲除突变体的传统方法周期较长,为了快速检测和高通量筛选具有特定功能的目标基因,本研究利用小分子RNA干涉技术,沉默了黄曲霉毒素生物合成关键基因,有效降低了黄曲霉毒素B1(AFB1)的生物合成。通过设计合成人工小干涉RNA(artificial siRNA),特异靶向黄曲霉毒素合成路径的关键基因aflR,将siRNA直接转化黄曲霉原生质体,有效沉默了黄曲霉毒素合成的关键调控基因aflR,并导致AFB1的合成明显减少。利用特异靶向黄曲霉毒素合成路径中其他11个靶标基因的siRNAs,通过原生质体转化方法可直接沉默这些基因,沉默后这些基因的转录水平均显著降低,其中hypC和aflW两个基因沉默后AFB1的生物合成量与对照相比下降显著。此外,利用特异靶向黄曲霉毒素合成基因簇外基因的siRNA,如pks-nrps基因,通过siRNA干涉技术沉默该基因同样可显著降低AFB1的合成。因此,本研究借助小分子RNA干涉技术,建立了一种快速检测和高通量筛选黄曲霉毒素生物合成路径相关基因的反向遗传学方法。 相似文献
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为了解辣椒CaBRI1基因结构特征及功能,本研究以辣椒自交系6421为实验材料,克隆CaBRI1基因,对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、表达模式分析,并采用病毒沉默(VIGS)初步验证该基因在辣椒中的功能。结果表明,CaBRI1编码区序列长3 642 bp,编码1 213个氨基酸;CaBRI1蛋白包含6个亮氨酸重复与1个磷酸激酶结构域,具有2个跨膜区域,N端跨膜螺旋可能为信号肽。洋葱表皮细胞GFP瞬时表达结果显示CaBRI1定位于细胞膜。RT-qPCR分析表明,6421同一发育时期不同组织中CaBRI1表达量存在显著差异,且都为茎尖中表达量最高。VIGS沉默6421中CaBRI1后,沉默植株发育迟缓、株高变矮,CaBRI1表达量显著下降。本研究结果可为进一步阐明CaBRI1在辣椒中的生物学功能提供参考。 相似文献
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VIGS:植物功能基因组学研究的革命 总被引：3，自引：1，他引：2
病毒诱导基因沉默(vims induced gene silencing,VIGS)技术是一种RNA介导的抗病毒防御反应机制,目前在植物反向遗传学领域已经表现出巨大的潜力.VIGS技术不仅优于传统的植物转基因技术,方法简便,高效耐用,而且具有高通量特性.在功能基因组学领域的研究中,这些优越性已经使VIGS技术成为最具吸引力的首选技术手段.目前,VIGS体系应用最成功的植物是病毒学家常用的模式植物一本氏烟草(Micotiana benthomiana),与此同时,也在努力改良VIGS技术,使其能够在包括单子叶植物在内的其它物种中得到广泛应用.我们讨论的重点是针对利用VIGS技术来确定基因功能,该技术已经在抗病性,逆境胁迫,细胞信号传导以及次生代谢生物合成途径研究中显示出相关基因功能的多样性,并随之构建出一系列新的相关模型. 相似文献
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《棉花学报》2021,33(4)
【目的】研究陆地棉DEAD-box RNA解旋酶基因GhRH39在叶片发育中的功能。【方法】借助生物信息学方法分析GhRH39的基因结构和进化关系,利用实时定量聚合酶链反应PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析该基因在棉花不同组织和叶片不同发育时期的表达情况,利用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术对该基因进行沉默。观察阳性植株表型,检测其光合色素含量变化,对阳性植株中叶绿体发育和光合色素合成相关基因进行表达量检测。【结果】Gh RH39编码620个氨基酸,且序列较为保守。qRT-PCR分析表明,该基因在根、茎、叶片、顶芽、花瓣、纤维中均有表达,在叶片中表达量较高,且在叶片中的表达量随着叶片发育进程而变化。利用VIGS技术成功降低了GhRH39的表达水平,基因沉默的阳性棉株出现失绿表型,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素3种光合色素含量均降低。阳性沉默棉株的叶绿体发育和光合色素合成相关基因表达量出现一定程度的下降。【结论】GhRH39基因影响棉花叶绿素和类胡萝卜素合成,同时影响叶绿体发育过程。 相似文献
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棉花黄萎病(Verticillium dahliae)是一种土传性真菌维管束病害,严重影响棉花的生产。本研究通过转录组数据分析筛选出一个与棉花黄萎病相关的氨基酸转运蛋白GhAAT基因,该基因在棉花根部响应黄萎病菌诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能。结果显示将该基因在棉花TM-1的叶片和根部沉默后,棉花对黄萎病抗性减弱,证明GhAAT基因参与调控了棉花抗黄萎病功能。发掘棉花抗黄萎病菌重要调控基因并揭示其分子机制对培育棉花抗病品种具有重要意义。 相似文献
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GhCPS基因沉默对棉花幼苗生长和内源激素含量的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
利用RT-PCR从棉花中获得493 bp的GhCPS(赤霉素(GA)合成酶基因)片段,经EcoRⅠ/KpnI双酶切后连入pTRV-RNA2质粒,获得了重组载体pTRV-GhCPS;用该载体转化农杆菌后,室内盆栽条件下侵染棉花品种欣抗4的子叶苗。结果表明,病毒诱导沉默GhCPS基因的棉花幼苗中GhCPS的表达量仅为空载体对照的52%。与空载体对照相比,沉默GhCPS的棉花幼苗第1叶和第2叶的内源GA4含量分别降低33%和60%;第2叶ABA含量降低48%,IAA、ZR和iPA含量均无显著变化;株高降低64%。第1叶和第2叶的叶面积分别减小26%和47%,总叶绿素含量分别增加29%和63%,类胡萝卜素含量分别增加27%和46%。第1叶的净光合速率、气孔导度、胞间CO2和蒸腾速率分别增加23%、40%、9%和31%。可见,利用病毒诱导基因沉默技术技术沉默GhCPS后可调控棉花幼苗叶片内源激素平衡,控制棉花幼苗的生长,并提高单位叶面积的光合能力。 相似文献
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病毒诱导的基因沉默的发展及在植物生物逆境上的应用 总被引：1，自引：1，他引：1
病毒诱导的基因沉默(Virus-indcued gene silencing, VIGS)技术是指带一段包基因序列的重组病毒侵染植物,引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的植物基因功能研究的新技术。为了进一步探讨VIGS应用策略,笔者归纳了VIGS的分子机理、VIGS的载体开发和VIGS技术在植物生物逆境方面的研究应用3 个方面近些年的研究进展,得出了VIGS在植物生物逆境方面的问题及应用价值。 相似文献
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非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer proteins,nsLTPs)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能。为研究nsLTPs在调控植物应答生物与非生物胁迫的反应中起的作用,本研究以本生烟(Nicotiana benthamiana)为材料,成功克隆非特异脂质转移蛋白NbLTP1全长基因,其开放阅读框序列为360 bp,编码119个氨基酸,分子重量为12.44 kD,为疏水性蛋白,等电点为7.45。对NbLTP1蛋白质三级结构进行了预测和分析,并进一步构建了烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的病毒诱导的基因沉默载体TRV:NbLTP1。荧光定量PCR结果表明通过VIGS可以显著抑制NbLTP1基因的表达。此外还通过In-Fusion克隆技术快速成功构建了pCAMBIA1305-NbLTP1-3*HA过量表达载体。本研究为下一步遗传转化、后续研究NbLTP1调控植物防御生物与非生物胁迫的分子机理、培育新种质提供理论依据。 相似文献
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真菌诱导子和抗褐变剂对喜树悬浮细胞生长及喜树碱生物合成的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
摘要：在试验的7种真菌中,最终浓度为30 mg/L的米根霉（Rhizopus oryzae）提取物作为真菌诱导子,在第18d加入可以使喜树（Camptotheca acuminata Decaisne）悬浮培养细胞喜树碱的总产量达到最大。在试验的4种抗褐变剂中,最终浓度为2 g/L的植酸作为抗褐变剂,在第15d加入可以使喜树悬浮培养细胞的生长和喜树碱的总产量达到最大。2 g/L的植酸在第15d加入后,再在18d加入30 mg/L的米根霉诱导子处理后,细胞干重在第24d达到最大值26.9 g/L,是未作任何处理细胞干重最大值的1.2倍（对照的在第20d达到最大值22.4 g/L）。综合处理的细胞喜树碱总产量在第26d达到最高值34.2 mg/L,是未作任何处理的喜树碱总产量的9.0倍（对照的在第20d达到最大值3.8 mg/L）。 相似文献
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喜树水培体系中喜树碱、羟基喜树碱及其他组分的初步鉴定 总被引：2，自引：2，他引：0
为初步建立喜树水培体系并确定从其根系分泌物中提取喜树碱和羟基喜树碱的可行性,以喜树为研究对象,采集喜树幼苗,进行无土水培。利用高效液相色谱(HPLC)和气质联用(GC-MS)技术鉴定分析根系泌物中的喜树碱、羟基喜树碱以及其他成分。结果表明,喜树在水培体系中能够正常生长,根系发达,根系分泌物中存在一定含量的喜树碱、羟基喜树碱以及邻苯二甲酸二丁酯等化感物质。 相似文献