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SKP2A是调控细胞周期转录因子降解的F-box蛋白。为研究该蛋白在小麦-叶锈菌互作过程的作用,首先克隆获得中国春小麦Ta-SKP2A全长序列,然后将其与pGBKT7载体连接,转入酵母Y187感受态细胞中,构建酵母诱饵表达载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性和自激活效应。结果表明,Ta-SKP2A编码区序列长度为1 146 bp,其ORF区编码一条由382个氨基酸组成的多肽。在ORF区两侧连接酶切位点(EcoRⅠ和Bam HⅠ),并将其与载体pGBKT7连接,成功构建了包含目的基因的诱饵载体pGBKT7-Ta-SKP2A,且含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,其过夜培养物OD6000.8,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性。含重组诱饵质粒的酵母菌株在二缺、三缺及四缺营养缺陷平板上不能生长,表明诱饵质粒的表达产物不能自激活报告基因。成功构建了一个包含Ta-SKP2A的重组诱饵质粒,为深入筛选与其互作的靶蛋白,研究其在小麦-叶锈菌互作体系中的作用机制奠定了基础。 相似文献
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玉米淀粉分支酶SBEIIb基因片段酵母双杂交诱饵载体 总被引：1，自引：1，他引：0
为探寻玉米淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBEIIb)与其互作蛋白的作用位点,构建了酵母双杂交诱饵载体。根据CDD和NCBI对SBEIIb蛋白氨基酸序列的分析,确定玉米SBEIIb的功能域及非功能域,PCR扩增功能域及非功能域基因的目的片段,经回收纯化,用相同的限制性内切酶将其与载体pGBKT7进行双酶切后,分别将目的基因片段与载体pGBKT7进行连接。构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SBEIIb-X(X=1,2,3,4,5,6),转化酵母菌AH109的菌液,OD600值在0.8以上,证明诱饵载体pGBKT7-SBEIIb-X对酵母菌AH109没有毒性作用;转化诱饵载体后的酵母菌AH109,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal平板上不能生长,排除了pGBKT7-SBEIIb-X具有自激活宿主菌AH109的作用。构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7- SBEIIb-X(X=1,2,3,4,5,6),其表达对酵母细胞无毒性及对报告基因无自激活作用,可为下一步分析SBEIIb与其互作蛋白的作用位点奠定基础。 相似文献
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为了筛选与拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6相互作用的蛋白,构建其酵母双杂交诱饵表达载体。本研究利用PCR方法扩增得到拟南芥AtCYS6的基因片段,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵表达载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过醋酸锂法将诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6与空载体pGBKT7分别转化到Y2HGold酵母菌株,检测其是否有自激活能力以及对宿主酵母菌株是否有毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了AtCYS6基因,成功构建了无自激活和没有毒性的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6。本研究结果可进一步为筛选与AtCYS6相互作用的蛋白质及功能研究提供科学依据。 相似文献
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为了筛选与马铃薯StERF5转录因子相互作用的宿主蛋白,构建其诱饵载体,本研究利用PCR方法扩增得到马铃薯StERF5基因的编码序列,克隆至载体p MD18-T,验证正确后插入到酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-StERF5及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGlod感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性。结果表明:扩增得到StERF5基因,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-StERF5,此诱饵载体对酵母宿主细胞无毒性且不具自主激活报告基因的功能。研究结果可为进一步利用酵母双杂交技术筛选与ERF5基因互作的宿主蛋白及功能研究提供科学依据。 相似文献
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甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测 总被引：2，自引：0，他引：2
为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。 相似文献
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摘 要: 【目的】 构建表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌并进行验证。 【方法】 对流产布鲁氏菌疫苗株S19外膜蛋白基因omp25设计特异引物进行PCR扩增,连接到pGM-T载体上,获得pGM-T-omp25,进行PCR扩增、酶切、测序鉴定。将质粒pGM-T-omp25与pGBKT7载体进行EcoRⅠ/SalⅠ双酶切,回收DNA片段,并进行连接,构建pGBKT7-omp25后,转化酿酒酵母菌Y187,并进行PCR鉴定、自激活实验和毒性检测。 【结果】 克隆了流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25,PCR、酶切、测序表明成功构建了pGBKT7-omp25真核表达载体,获得的转化子酵母Y187菌株无自激活活性,无毒性。 【结论】 成功构建了表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌,为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定基础。关键词：流产布鲁氏菌;基因omp25;酿酒酵母Y187;真核表达 相似文献
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为了筛选与马铃薯超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)基因StSOD1作用的上游蛋白,构建其酵母双杂交诱饵重组载体。本研究利用PCR方法扩增得到马铃薯StSOD1的基因片段,通过与pMD-T18连接构建克隆载体,经验证构建成功后,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵重组载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过PEG/Li Ac法将诱饵载体pGBKT7-StSOD1与空载体pGBKT7分别转化到酵母AH109感受态细胞中,检测其是否有自激活作用和对酵母菌株的毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了StSOD1基因,成功构建了诱饵重组载体pGBKT7-St SOD1,并且此诱饵载体无自激活活性和对酵母菌株的毒性作用。此研究结果可进一步为筛选与StSOD1互作的蛋白质及功能研究提供科学依据。 相似文献
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成花诱导是开花植物生长发育过程中最为重要的一环,而开花整合因子Flowering Locus T(FT)在这一过程中起非常重要的调控作用。目前,FT基因调控芒果成花的作用机制尚不清楚。本研究以‘四季蜜芒’为材料,克隆验证了从转录组测序数据中挖掘获得的3个FT同源基因,命名为MiFT1、MiFT2和MiFT3。生物信息学分析显示,3个MiFTs基因编码区长度分别为588 bp、540 bp和516 bp,分别编码氨基酸196个、180个和172个,分子量分别为48.97 kD、44.71 kD和42.27 kD,等电点分别为4.99、5.06和5.06,3个基因均含有一个保守的PEBP结构域。将MiFT1、MiFT2和MiFT3基因定向克隆到酵母表达载体pGBKT7上,通过菌落PCR和测序进行验证,并成功转化酵母菌株Y2H Gold感受态细胞。对诱饵质粒酵母菌进行自激活和毒性检测,发现pGBKT7-MiFT1、pGBKT7-MiFT2和pGBKT7-MiFT3在酵母菌种均不具备自激活性和毒性。此酵母诱饵蛋白表达载体被成功构建,为后续蛋白互作筛选提供参考。 相似文献
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BYDV-GAV外壳蛋白和复制酶基因酵母双杂诱饵载体的构建及表达 总被引：1，自引：0，他引：1
在植物病毒侵染过程中,病毒蛋白能够与寄主蛋白发生相互作用以利于病毒的复制、积累和扩散。酵母双杂交系统是体外研究蛋白相互作用的有利工具,其在致病机制研究中得到广泛的利用。本研究利用大麦黄矮病毒(BYDV)外壳蛋白(CP)和依赖RNA的复制酶(RdRp)基因的全长序列,构建了这2个基因的酵母双杂诱饵载体pG-BKT7-CP和pGBKT7-RdRp,并转化酵母进行表达分析。含有pGBKT7-CP和pGBKT7-RdRp诱饵载体的酵母,在SD/-Trp固体培养基和SD/-Trp/Kan液体培养基中都能正常生长,但在SD/-Ade/-Trp/X-Gal和SD/-His/-Trp/X-Gal培养基上不能生长。结果表明,这2个载体表达的融合蛋白对酵母没有毒害作用,且自身没有激活性,可作为酵母双杂系统的诱饵载体,用来分析与外壳蛋白和复制酶相互作用的蛋白。 相似文献
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构建葡萄赤霞珠(Vitis vinifera L.cv Cabernet Sauvignon)花色苷合成前体酶——类黄酮葡萄糖基转移酶(UDPG-flavonoid-3-O-glycosyltranferase,Ufgt)诱饵表达载体。通过RT-PCR扩增获得葡萄ufgt基因CDS序列,与p GBKT7酵母诱饵载体连接;经测序和双酶切鉴定后,转化酵母菌株AH109,分析Ufgt蛋白在酵母菌株中的表达情况。成功扩增出ufgt基因CDS全长,并成功构建了p GBKT7-ufgt,重组载体p GBKT7-ufgt成功的转化到AH109酵母菌株中,且无毒和自激活性,能够正确稳定的表达。p GBKT7-ufgt酵母诱饵蛋白表达载体被成功构建,为后续Ufgt蛋白互作筛选奠定基础。 相似文献
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植物小分子热激蛋白(small heat shock proteins, s HSPs)是一种多样、古老的蛋白家族,分子量大小普遍在12~42 k D之间,包含典型的C端、N端和α晶状体蛋白域。s HSPs作为一种重要的分子伴侣在植物生长发育和响应逆境胁迫中起着重要的作用。本研究通过构建成熟期番茄果实cDNA文库,筛选与SlHSP17.7互作的蛋白,进而探索SlHSP17.7在果实发育进程中的分子机制。以Micro-Tom番茄绿熟期、转色期和完熟期果实cDNA为模板,构建番茄果实c DNA文库。构建pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体筛选与其互作的蛋白,利用酵母双杂交实验验证互作关系。经检测番茄果实cDNA文库库容是2.2×10~6CFU,工作液细胞密度是3.6×10~7cell/mL,均一化程度>106,结果符合质控要求。将pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体转化Y2HGold酵母菌株检测发现,其无毒性和自激活现象,经筛选c DNA文库、测序及序列比对分析得到钙阳离子交换体SlCCX1-like蛋白,利用酵母双杂交实验验证发现二者存在互作关系。经PCR鉴定后,所建文库质量良好,文库的库容和文库滴度均符合建库要求,用pGBKT7-SlHSP17.7诱饵载体筛选得到互作蛋白SlCCX1-like,为进一步研究在果实发育进程SlHSP17.7的生物学功能提供了保障。 相似文献
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为研究SPT和HECs及其相互作用对甘蓝雌蕊发育的影响, 以结球甘蓝自交不亲和系E1为材料, 提取雌蕊总RNA, 根据拟南芥中SPT和HEC1基因设计引物, 采用同源克隆的方法克隆SPT基因, 其序列1085 bp, 开放阅读框(ORF) 1062 bp; HEC1基因ORF 696 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列表明, SPT编码353个氨基酸残基, 预测分子量为37.67 kD, pI为6.83; HEC1编码231个氨基酸残基, 预测分子量为25.26 kD, pI为10.2。分析表明, 两基因在各器官中均表达, 但SPT在果实和雌蕊中表达量最高, 而HEC1在根和花蕾中的表达量最高。为检测两者的相互作用, 构建原核表达质粒pCold I-SPT和pGEX-HEC1, Pull-down试验表明两蛋白能够在体外相互作用。同时构建pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1及互换载体pGBKT7-HEC1和pGADT7-SPT酵母表达载体, 分别转化酵母Y2HGold和Y187感受态细胞后均未出现自激活和毒性现象, 融合后的二倍体酵母均能在SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-α-gal/AbA板上长出蓝色菌斑, 表明SPT和HEC1能够相互作用激活下游的HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2报告基因, 酵母双杂交试验结果与Pull-down检测一致, 说明SPT和HEC1能够相互作用以调控雌蕊的发育。 相似文献
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拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制,以拟南芥基因组DNA为模板设计引物,扩增获得AtSTK基因的启动子序列,并构建到报告载体pAbAi,将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ进行单酶切线性化,转化酵母菌株Y1H Gold,线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后,将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌,将菌液涂布到含有100 ng/m L Ab A的SD/-Leu培养基上进行阳性克隆的酵母单杂交筛选。通过回复鉴定、序列测定,最终筛选获得了可能参与AtSTK基因表达调控的4个拟南芥基因。测序结果表明,酵母单杂交筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域,为WRKY类转录因子的一员。因此,AtSTK基因的表达很可能接受MAPK信号传导途径中AT3G32090基因编码的WRKY类转录因子的调控,从而影响拟南芥植株的耐盐性。 相似文献