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1.
应用PCR方法扩增了牛瑟氏泰勒虫吉林株P33表面蛋白基因片段,并将扩增产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建P33重组pGEX-4T-3表达载体,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后.进行SDS-PAGE、免疫印记分析.结果显示,获得P33基因完整开放阅读框长868 bp,编码292个氨基酸,与中国株同源性为99.1%;表达的融合蛋白相对分子质量为59 000,能被牛瑟氏泰勒虫阳性血清识别,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性. 相似文献
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为探索牛瑟氏泰勒虫的表面蛋白基因融合产物作为双价疫苗的可行性,以牛瑟氏泰勒虫基因组DNA为模板,通过重叠延伸拼接聚合酶链式反应（SOE-PCR）把P23和P33表面蛋白基因连接一起,2个基因之间插入一个linker（Gly4Ser）3,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得1151bp的双基因融合片段,克隆于表达质粒pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-P23-P33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小70．0ku的融合蛋白。Western blot检测结果显示,该蛋白与牛瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究此融合蛋白作为疫苗候选成分提供了理论依据。 相似文献
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为了研发牛瑟氏泰勒虫病基因工程亚单位疫苗,本实验将p23-IL-18融合基因克隆到pET-28a原核表达载体,构建pET-28a-p23-IL-18重组原核表达质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定后在37 ℃用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,成功构建牛瑟氏泰勒虫pET-28a-p23-IL-18原核表达质粒,目的基因在大肠杆菌中成功获得表达,融合蛋白的分子量约为48ku,并被牛瑟氏泰勒虫阳性血清所识别,具有良好的反应原性。本研究结果为牛瑟氏泰勒虫病基因工程亚单位疫苗的制备奠定了基础。 相似文献
4.
目的构建牛瑟氏泰勒虫表面蛋白p33基因的真核表达载体。方法根据已发表的牛瑟氏泰勒虫（Thei-leria sergenti）表面蛋白p33基因的核苷酸序列设计引物,应用PCR技术从牛瑟氏泰勒虫基因组DNA中扩增p33基因片段并克隆入pMD18-Tsimple载体。进一步将该基因插入到真核表达载体pVAXⅠ,转染Hela细胞后进行RT-PCR检测和IFA检测。结果牛瑟氏泰勒虫表面蛋白p3基因成连接到pVAXⅠ载体中,并在真核细胞中有效表达。结论本研究试验为今后该基因的进一步动物试验奠定了基础。 相似文献
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构建牛瑟氏泰勒虫P23基因片段原核重组表达质粒,表达重组蛋白。采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因,将扩增产物与pMD18-T-Simple载体连接,测序,验证扩增产物。将P23基因片段克隆到载体pGEX-4T-3上,经酶切分析、PCR鉴定后,IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物。结果表明克隆的P23基因片段为684 bp,重组质粒pGEX-4T-3/P23构建成功;SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为58 ku;Western blotting分析结果显示,与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生反应,而与牛瑟氏泰勒虫阴性血清无反应,表明牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白具有良好的抗原性和特异性,提示可以利用融合蛋白来建立检测抗体的间接ELISA诊断方法。 相似文献
7.
为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70(HSP70)基因片段原核重组表达质粒,本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70基因序列(D12692.1),应用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,扩增片段大小为1 692bp,与参考序列的同源性为99%。将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSP70,本试验为进一步研究牛瑟氏泰勒虫HSP70基因佐剂作用、研制基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
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为构建牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因真核表达质粒,以牛瑟氏秦勒虫基因组DNA为模板,应用SOE—PCR技术得到牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因,将其先克隆到pMD18T—Simple载体,再亚克隆到真核表达载体pVAX1中,得到重组质粒pVAX1—2p33。对该重组质粒进行PCR、酶切鉴定及测序后,采用脂质体法将其转染到BHK-21细胞,用RTPCR和IFA进行鉴定。结果表明,牛瑟氏泰勒虫p33双拷贝基因真核表达质粒pVAX12p33构建成功并可以在BHK-21细胞中表达。本试验结果为p33双拷贝基因的免疫学研究奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(9):1527-1530
为研究牛IL-18基因对瑟氏泰勒虫p33疫苗的免疫佐剂效应,根据GenBank上已经发表的p33基因序列和牛IL-18基因序列(IL-18)设计2对特异性引物,以瑟氏泰勒虫基因组DNA和pMD-19-T-IL-18质粒DNA为模板,采用SOE-PCR技术将2个基因连接在一起,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,获得1 416bp的目的基因IL-18-p33,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-1-IL-18-p33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小为79 000的融合蛋白。Western blotting检测结果显示,该蛋白与瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究IL-18对瑟氏泰勒虫p33基因疫苗的免疫佐剂效应奠定了基础。 相似文献
10.
根据GenBank(D12692.1)上发表的牛瑟氏泰勒虫HSP70基因序列设计、合成1对特异性的引物,采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫HSP70基因片段,将扩增产物与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后测序;用pGEX-4T-1表达载体构建重组质粒pGEX-HSP70,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE、Western-blot分析。结果表明:扩增的HSP70基因与D12692.1序列同源性为99.3%;表达的融合蛋白分子质量约为68ku,而且可与牛瑟氏泰勒虫阳性血清发生特异性反应。 相似文献