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1.
为了获得热稳定性有所提高的β-葡聚糖酶，本研究利用定向进化技术对β-葡聚糖酶基因进行改造，并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。结果获得了两株热稳定性有所提高的突变体，分别命名为EGs1和EGs2；酶学性质分析结果显示：与野生酶相比，EGs1和EGs2突变酶的Tm值分别提高了3℃和5℃，达到了65.5℃和67.5℃；突变酶的最适反应温度也提高了5℃，达到了60℃；两个突变酶对地衣多糖的水解能力分别被提高28％和降低21.6％；对地衣多糖的亲和力未见改变；野生酶和EGs1突变酶的最适pH值为6.5，而EGs2突变酶的最适pH值为7.0；野生型和突变型-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围，在pH 6.0-8.5的范围内放置48小时，仍保持80％以上的酶活力；遗传稳定性检验结果表明突变株的遗传稳定性良好。这一结果说明了定向进化在改善酶性质方面是比较有效的策略。 相似文献
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基因工程菌EGs2产β-葡聚糖酶条件优化及产酶特性 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要：用乳清粉作为主要培养基组成，采用正交试验对重组菌EGs2的发酵条件进行了优化，并对粗酶液的酶学性质进行了研究。重组菌EGs2的最佳发酵条件为：摇床转速170 r•min-1，接种量1 ％，发酵培养基初始pH值6.0，种龄12 h。重组菌EGs2β－葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关，发酵14h后，菌体生物量最高可达1.71 g•L -1，β－葡聚糖酶活力最高可达321.56 U•ml-1。所得粗酶液的最适反应温度和pH值分别为60 ℃和6.0，在70 ℃以下保温20 min后，残余酶活力均在80 %以上。在pH 5.0-9.0 放置48 h后仍能保持均90 %以上的残余酶活力。 相似文献
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啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化 总被引：7，自引：1，他引：7
对产β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A302菌株进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合诱变和选育，获得产β-葡聚糖酶达27．3U／mL的突变株H302。采用均匀实验设计对H302菌株产β-葡聚糖酶的液体培养基组成及发酵条件进行优化实验，所获优化配方(W／V)为麦麸1．41％，鱼粉0．80％，硝酸钾0．34％，硫酸镁0．11％，起始pH6．0；用含孢量10^8个／mL的种子菌液按体积比3．3％接种上述液体培养基，在36℃下发酵52h，菌株H302的产酶活力达到115．1U／mL，是原出发菌株及培养条件下产酶活力的9．4倍。对突变株H302所产β-葡聚糖酶性质的研究表明，该酶最适作用温度为60℃，最适作用pH为5．5，适用于啤酒生产中的麦芽糖化。 相似文献
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绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。 相似文献
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从秸秆还田土壤中初筛获得一株高效纤维素降解菌CMC-4,根据菌株形态、理化性质及16S rDNA序列分析,初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。以此为出发菌株,经亚硝酸钠诱变获得一株稳定高产纤维素酶突变株CMC-4-3。对CMC-4和CMC-4-3的产酶条件和酶学性质进行比较分析,结果表明:CMC-4-3纤维素酶活力较CMC-4提高67.5%;其最适产酶条件是:37℃、pH 6.0、葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、接种量2.0%、装液量60 ml/250 ml。该菌株所产纤维素酶的最适反应pH为6.0,且在4.0~7.0酶活力较稳定;最适反应温度为50℃,在20~80℃范围内均保持稳定;金属离子Fe~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、K~+对酶有激活作用,其余离子均有不同程度抑制作用,而Cu~(2+)和Ca~(2+)抑制作用最强,酶活力减弱近50%,是该酶的强效抑制因子。诱变前后菌株产酶条件和酶学性质等部分表型发生了变化,而突变菌株显示出了更宽泛的环境适应范围。据此,获得一株高效产纤维素酶、耐受范围广的具纤维素降解能力的地衣芽孢杆菌,而CMC-4-3和CMC-4的表型可作为深入探讨基因型变化的线索。 相似文献
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以费氏弧菌（Vibrio fischeri）EM17基因组DNA为模板，通过PCR方法克隆了该菌的β-内切葡聚糖酶基因（GenBank Accession Number : EF533943）。将其插入到表达载体pGEX-6p-1中，转化大肠杆菌BL21（DE3），诱导表达。测序结果经DNAMAN软件分析，该基因与GeneBank中费氏弧菌 ES114基因组预测的β-内切葡聚糖酶基因同源性达到97.1％，但与GeneBank中其他β-内切葡聚糖酶基因同源性较低。酶学性质研究表明，该酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为9.0。同时研究了6种金属离子对该酶活性的影响，结果显示该酶活性依赖金属离子的存在 Mg2+，Ca2+对酶有激活作用，Mn2+, Pb2+则严重抑制该酶的活性。 相似文献
7.
β-葡萄糖苷酶来源广泛,几乎存在于所有的生物体中,而不同来源的β-葡萄糖苷酶其性质也各不同。本文利用七叶苷分离培养基从土样中分离筛选出产6种β-葡萄糖苷酶时间较快的菌种,其中发现菌种WGEA1酶活性较高,随后对菌种WGEA1进行初步的鉴定并且采用DNS法测该菌株所产粗酶液的酶学特性。酶学特性表明,WGEA1产的β-葡萄糖苷酶最适温度是在50～55℃之间,最适pH在6～7之间;在低于50℃条件下,pH为5～8时,酶活较稳定,同时在最适反应时间30min下,金属离子和有机溶剂都对酶活性影响很大,这些发现都为在非水相体系中酶法合成烷基糖苷奠定了一定的基础。 相似文献
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一株烟草秸秆降解菌的分离、鉴定及酶学性质研究 总被引：2，自引：1，他引：2
从皖南地区烟稻轮作田土壤中经CMC-Na初筛获得5株纤维素降解菌,经DNS法测定纤维素酶活性复筛得到一株降解活性较高的降解菌YC-2。根据该菌16S r DNA序列比对结果,结合形态和生理生化特征,确定YC-2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对YC-2酶学性质进行相关研究,并分析YC-2对烟碱的耐受情况及对烟草秸秆的降解情况,结果表明:在7天内,YC-2对烟草秸秆降解率为10.14%;酶学特性表现为最适反应温度为60℃且在15~60℃之间具有稳定性;最适反应pH为7.0,在pH 4.0~7.5范围内稳定性较好;YC-2在浓度为1~2 g/L烟碱中能快速生长,而在高浓度的烟碱中生长受到抑制。因此,菌株YC-2产纤维素酶活性较高、相对耐热耐碱且对烟杆有一定分解作用,通过进一步诱变选育和发酵条件优化有较好的田间应用潜力。 相似文献
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杏鲍菇产木聚糖酶固态发酵条件优化及其酶学性质 总被引：1，自引：0，他引：1
本文利用啤酒糟为主要原料,以杏鲍菇为菌种进行木聚糖酶发酵研究。通过单因素和正交试验确定最佳培养条件,并对其粗酶的酶学性质进行研究。结果表明,各因素对产酶能力的影响大小依次为:培养时间、料水比、氮源、pH、碳源。固态发酵的最佳培养条件为:碳源为以6∶2∶2配备的啤酒糟、玉米芯、麸皮混合物,氮源为1.5%的酵母膏,pH为5,装瓶量为7g/50ml三角瓶,接种量为25%,培养天数为9d,料水比为1∶1.6。其粗酶液的最适反应温度为50℃,最适pH为6。在pH为4～7时酶的稳定性较好,但木聚糖酶的热稳定性较差,60℃以上时酶活力损失70%以上。 相似文献
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纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制,为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,本研究利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis )C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,在酶分子水平上改造内切葡聚糖酶分子.实验获得了最佳突变株b-15和b-28,其内切葡聚糖酶活力比亲本酶分别提高了2.1和3.6倍.序列分析表明:突变体b-15有6个碱基发生了突变,分别是A360G、T402A、A419T、T648A、A1208G和A1397T,导致4个氨基酸突变,分别是N134K、Q140L、N403S和Q466L;b-28只有1个碱基发生了突变,导致了398位Lys突变为Arg.通过SWISS-MODEL服务器模拟酶的三维结构,分析表明,b-15改变的4个氨基酸分别位于催化结构域的第4和第5个α螺旋之间的转角和结合结构域的第5个β折叠及第9和第10个β折叠之间的转角;b-28的突变位于结合结构域的第4个β折叠.同时,对获得的两株突变株b-15和b-28用正交试验优化产酶条件,优化后的酶活分别达到4.542和5.136 U/mL,是优化前的2.2和1.5倍.实验获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料. 相似文献
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β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础. 相似文献
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对低温淀粉酶资源的开发是功能酶研究的新热点,本研究从东帕米尔高原江布拉克冰川冻土中分离获得多株高产低温淀粉酶菌株,最高产酶菌株D5-2经16S rDNA鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌.对D5-2所产淀粉酶性质进行初步分析,结果表明,其最适作用温度和pH值分别为25 ℃和6.5,酶的热稳定性较差,40 ℃处理1h后酶活急剧下降,至70℃酶活力仅存23％;在pH 5.5～8.0条件下,酶活力相对稳定;Mn2+和Mg2+对淀粉酶有激活作用,而乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、Fe2+和Na+则抑制酶活.结果提示,菌株D5-2分泌的淀粉酶符合低温酶特性,应用空间较大,值得深入探究开发. 相似文献
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环状芽孢杆菌乳糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析 总被引：6，自引：0，他引：6
摘要: 将环状芽孢杆菌(Bacillus circulans )中的乳糖酶基因在大肠杆菌(Escherichia coli )中进行了高效表达, 并测定了表达的乳糖酶的基本酶学性质。结果表明, 表达的乳糖酶有生物学活性, 但与来源于环状芽孢杆菌的原始酶相比, 其酶促反应的最适pH、最适温度、Km值, 以及酶的pH稳定性和温度稳定性等酶学性质均有较大变化。表达的乳糖酶最适pH为5.0, 低于原始酶的pH 6.5; 最适温度为37 ℃, 而原始酶为55 ℃; 其耐酸性、耐热性及对金属离子的抗性等方面比原酶有所提高; 而且表达的乳糖酶Km比原始酶小285倍、Vmax比原始酶大5.4倍，表明经大肠杆菌表达的乳糖酶有较高的底物亲和力，酶促反应效率更高。从乳糖酶的单位表达量来看, 原始酶在环状芽孢杆菌的表达量为20.98 U/mL，而在大肠杆菌中的表达量提高到33.102 U/mL。 相似文献
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一株产高温蛋白酶耐热菌BY25的产酶条件与酶学性质研究 总被引：1，自引：0，他引：1
对菌株BY25的生长条件、产酶条件及其产生的蛋白酶的酶学性质进行了研究。结果发现,BY25的最高生长温度为55℃,最适生长温度为50℃,最佳产酶温度为30℃,最佳培养起始pH为8.0,最佳C源为葡萄糖,高通气量明显提高菌株产酶能力。在以上条件下培养52 h,上清液蛋白酶活力达4 170 U/ml。酶学性质研究表明：该蛋白酶为高温中性金属蛋白酶,最适反应pH为7.0,最适反应温度为55℃,具有良好的pH耐受性和较好的热稳定性;EDTA能强烈抑制酶活力,而Fe2+、Cu2+对酶活力也具有一定抑制作用。 相似文献
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地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达 总被引：5，自引：0，他引：5
提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因组，通过PCR克隆了该菌的β-1，3-1，4．葡聚糖酶基因全长。该基因全长818bp,ORF为732bp,编码243个氨基酸，计算分子量为27.35kD，等电点为8．31。经Blast分析，该序列与短小芽孢杆菌(B．pumilus)同源性最高(99％)，而与基因库中地衣芽孢杆菌的同源性为94％，该基因已被GenBank接受(AY225317)。用BamHI和XhoⅠ双酶切目的片断和表达载体pET-30a( )后相连接，构建重组表达载体pET-lic，并导人大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达。酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在27kD左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达67．34U／mL，是出发菌的60倍，最适温度在50℃左右，最适pH在5～6之间。该工程菌可作为材料构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。 相似文献
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β-D-1,4-内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase,xynA,EC.3.2.1.8)简称β-木聚糖酶(β-xylanase),是木聚糖降解酶系中最重要的成员,广泛用于饲料、食品、造纸和生物能源等领域.厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 xynA具有潜在的开发价值,但是其异源表达的活性较低.本研究根据毕赤酵母(Pichia pastoris)对基因密码子偏好性,对厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的xynA进行密码子优化.通过全基因合成技术合成优化后的xynAm,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的多克隆位点,构建重组质粒pPIC9K-xynAm,电击转化至毕赤酵母GS115菌株中,以29℃、0.5％甲醇诱导表达,获得重组xynA,并对该酶的酶学特性进行了研究.结果表明,在摇瓶水平条件下,诱导表达108 h时重组β-木聚糖酶活性达到最大值,为612 IU/mL.在10L发酵罐中诱导表达96 h后,xynA的活性为3 515 IU/mL,比活性为2 411 IU/mg;菌体培养湿重、干重和培养上清总蛋白质的浓度分别为324、156和2.25 g/L.非变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)凝胶电泳显示,重组木聚糖酶的分子量约为42.7 kD.酶学性质分析表明,重组β-木聚糖酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH 6.0,在温度为30～50℃、pH 4.0～10.6之间该酶具有较好的稳定性,其Km=27.86 mg/mL,Vmax=277.78 mg/(mL· min).底物特异性分析表明,重组xynA可水解低粘度阿拉伯木聚糖、高粘度阿拉伯木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖,但不降解大麦(Hordeum vulgare)β-葡聚糖和地衣多糖.10 mmol/L的Co2+和K+对该酶的活性略有激活作用,Mn2+、Fe2+和SDS对该酶活性有一定的抑制作用.本研究为进一步工业化应用来源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的β-内切木聚糖酶奠定了基础. 相似文献
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热稳定性β-葡聚糖酶菌种选育及产酶特性 总被引：5，自引：0，他引：5
从土壤中筛选到一株热稳定性β－1，3－1，4－葡聚糖产生菌ZJF－1，发酵60h酶活性为64U／mL，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)。紫外线和硫酸二己酯复合诱变，获得的突变株ZJF－1A5发酵60h酶活性达154．7U／mL，是出发菌株酶活性的2．42倍，对B.subtilis ZJF-1A5产酶特性的研究发现：大麦粉，糊精，可溶性淀粉等糖有利于β－1，3－1，4－葡聚糖酶的产生，葡萄糖，麦芽糖等单糖和双糖不利于菌体生长和产酶。B.subtilis ZJF-1A5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的产生与菌体生长部分相关，在细胞进入对数生长后期至稳定期，酶活性显著增加，且β－葡聚糖酶活性与菌体生物量密切相关，B.subtilis ZJF-1A5 α－淀粉酶的产生也与生长部分相关，细胞进入对数生长期，α－淀粉酶开始大量产生，而中性蛋白酶的产生与菌体生长同步。 相似文献
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白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因Ba G,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有Ba G、Cbs 2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示Ba G基因的粗酶液pro Ba G无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液pro Cbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将Ba G和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35 k D,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的Ba G基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。 相似文献