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1.
《仲恺农业工程学院学报》2019,(3)
柑橘黄龙病是柑橘毁灭性病害,给世界柑橘产业造成了巨大的损失.利用PCR检测黄龙病病原菌是目前柑橘黄龙病诊断的可靠方法,具有快速、特异、高效灵敏等优点.前期已有文献报道过用于常规PCR检测的黄龙病检测引物,但尚无比较这些引物的灵敏性的报道.为了验证相关文献报道的3对引物检测柑橘黄龙病的灵敏度,本研究选择感病砂糖桔样品作为反应模板,并设置相同PCR反应条件下,分别利用3对特异性引物(P1/P2, P3/P4和OI1/OI2c)对10份砂糖桔感病样本总DNA进行扩增.结果表明,引物P1/P2灵敏度最低,扩增不出条带;引物P3/P4灵敏度较好,扩增条带明显,但个别样品扩增条带不明显;引物OI1/OI2c灵敏度最好,所有样品扩增条带均明显. 相似文献
2.
【目的】利用柑橘黄龙病病原亚洲种16S rDNA序列的特异引物检测疑似黄龙病的砂糖橘叶片样品,为砂糖橘黄龙病的综合防控提供理论依据。【方法】选取采自广西9市17个采样点的214份疑似黄龙病及无症状砂糖橘叶片样品,用试剂盒法提取叶脉基因组DNA,采用柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA特异引物进行PCR扩增,扩增结果在1%琼脂糖凝胶电泳上检测,统计待检样品柑橘黄龙病病原菌亚洲种的带菌率。【结果】对214份样品的Nested-PCR扩增结果,部分样品可得到1160 bp左右的特异条带,与预期大小相符但条带明暗不同。来自广西9市17个采样点的砂糖橘叶片样品均检测出黄龙病亚洲种病原,平均检出率均在66.0%以上,其中检出率最高的是来自东兴市的样品,检出率为100.0%,检出率最低的是来自南宁市的样品,检出率为66.9%;斑驳、缺素型黄化、叶脉黄化、小叶和无症状叶片样品中均可检测出黄龙病亚洲种。【结论】Nested-PCR技术具有灵敏度高、特异性强的特点,能够快速、准确检测出各种症状样品的黄龙病病原,可用于柑橘黄龙病的早期诊断。 相似文献
3.
[目的]利用柑橘黄龙病病原亚洲种16S rDNA序列的特异引物检测疑似黄龙病的砂糖橘叶片样品,为砂糖橘黄龙病的综合防控提供理论依据.[方法]选取采自广西9市17个采样点的214份疑似黄龙病及无症状砂糖橘叶片样品,用试剂盒法提取叶脉基因组DNA,采用柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA特异引物进行PCR扩增,扩增结果在1%琼脂糖凝胶电泳上检测,统计待检样品柑橘黄龙病病原菌亚洲种的带菌率.[结果]对214份样品的Nested-PCR扩增结果,部分样品可得到1160 bp左右的特异条带,与预期大小相符但条带明暗不同.来自广西9市17个采样点的砂糖橘叶片样品均检测出黄龙病亚洲种病原,平均检出率均在66.0%以上,其中检出率最高的是来自东兴市的样品,检出率为100.0%,检出率最低的是来自南宁市的样品,检出率为66.9%;斑驳、缺素型黄化、叶脉黄化、小叶和无症状叶片样品中均可检测出黄龙病亚洲种.[结论]Nested-PCR技术具有灵敏度高、特异性强的特点,能够快速、准确检测出各种症状样品的黄龙病病原,可用于柑橘黄龙病的早期诊断. 相似文献
4.
为确保湘南脐橙产业发展安全,严格防控柑橘黄龙病,从湘南地区几个脐橙种植园采集柑橘黄龙病疑似病株样品和健康植株样品,利用文献报道的柑橘黄龙病PCR检测常用引物对样品进行分子检测,并从病株组织中分离内生细菌进行分析鉴定。结果表明:在柑橘黄龙病的常规PCR检测中,湘南脐橙总核酸对P400引物的灵敏度最高,是湘南地区脐橙中柑橘黄龙病害常规PCR检测的最佳引物,其次为P535引物,而OI和16S这2对引物的灵敏度较低;对脐橙中柑橘黄龙病病株组织内生细菌的分离鉴定发现,柑橘中可培养内生细菌主要归类为7个属,分别为短杆菌属(Curtobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、异常球菌属(Deinococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus);其中,LB和1/10LB培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和芽孢杆菌属;而脐橙树叶汁培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和微杆菌属。 相似文献
5.
柑橘黄龙病是柑橘属植物主要病害之一,是由一种限于韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起的病害,病菌可随筛管转运至整个植株,其潜伏周期长、危害面积广,严重威胁我国乃至世界范围内柑橘产业的健康发展。因此,早期柑橘黄龙病的快速检测是病害防治重要环节,目前最常用的是基于PCR技术的检测方法,但由于植株体内的病菌含量较低、PCR扩增体系中引物稳定性的差异、DNA模板浓度的不同均会对扩增效果有较大影响。本研究以感染黄龙病的柑橘叶片作为样本,提取叶片DNA作为模板。利用LSS606/LAS、16sf/16sr、A2/J5、P1/P2和OI1/OI2 5对柑橘黄龙病检测引物对PCR反应体系进行了优化。结果显示,除了OI1/OI2引物的特异性较差外,其余4种引物均表现了很好的特异性,引物浓度在0.2~0.3 μmol时,PCR扩增效果较好。灵敏度检测显示引物LSS606/LAS、A2/J5对模板DNA的灵敏度较高,在模板浓度为0.048 ng·μL-1时仍能扩增出目标产物,分别是引物16sf/16sr和P1/P2检测灵敏度的10倍和20倍,可检测出1 ng总DNA中的柑橘黄龙病菌数在426~755。该研究通过特异性引物的筛选以及PCR检测体系的优化,确定了一种快速准确检测柑橘黄龙病的方法,为柑橘黄龙病的早期诊断奠定基础。 相似文献
6.
黄龙病是世界柑橘产业的毁灭性病害,引起柑橘黄龙病的病原分为亚洲种、非洲种和美洲种共3个种,目前我国柑橘黄龙病均由亚洲种引起,建立一套快速检测技术对我国柑橘黄龙病的防控具有重要意义.本研究根据柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA基因序列设计引物,建立了基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)的检测方法,并评价了该方法的灵敏度和检测准确性.结果表明,本研究所建立的柑橘黄龙病亚洲种RPA快速检测方法特异性强、灵敏度高、操作过程简便,检测灵敏度比常规PCR提高10倍,为基层农技人员开展柑橘黄龙病的快速检测提供了一种新方法. 相似文献
7.
湘南地区柑橘黄龙病的PCR检测 总被引：2，自引：0，他引：2
针对近年湘南部分柑橘产区出现叶片黄化、果实畸形及全株矮化、橘树枯死等柑橘黄龙病疑似症状,应用多聚酶链式反应(PCR)技术对湘南8个柑橘产区的柑橘进行了检测,结果发现6个柑橘产区有柑橘黄龙病为害.同时建立了一套快速、准确的柑橘黄龙病PCR检测技术体系. 相似文献
8.
《中国农业科学》2020,(8)
【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDa V没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱(Diaphorina citri)进行绿色防控。 相似文献
9.
梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用 总被引：1，自引：1，他引：0
本文利用TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测技术对梅州地区疑似柑橘黄龙病样品进行检测,并与常规PCR检测进行对比。结果表明,实时荧光定量PCR用于检测柑橘黄龙病菌结果快速、准确、可靠且无污染。采用2种方法对梯度稀释的阳性样本进行检测发现,实时荧光定量PCR的灵敏度较常规PCR更高,能够检出样品中痕量的病原菌。本研究在梅州地区建立了以实时荧光定量PCR方法进行柑橘黄龙病疑似植株的检测,可以为梅州地区提供更准确、更灵敏、快速的黄龙病检测技术。 相似文献
10.
《江西农业大学学报》2017,(2)
柑橘黄龙病是柑橘生产中的毁灭性病害,且该病病原菌中存在噬菌体/原噬菌体。原噬菌体序列是该病病原菌基因组动态变化的关键组分,对病原菌种内多样性起重要作用。为探明赣南地区柑橘木虱体内黄龙病菌原噬菌体类型的多样性,利用2对PCR引物对分别采自赣南赣州市、寻乌、于都、定南、瑞金、南康、崇义等7个不同柑橘产区的42头柑橘木虱阳性样品进行PCR检测和测序。结果表明在赣南地区柑橘木虱体内黄龙病菌株系原噬菌体类型的存在划分为4种:单一SC1类型、单一SC2类型、没有噬菌体类型和SC1-SC2噬菌体类型。其中单一的原噬菌体类型(SC1 or SC2)检测率达67%,而2种原噬菌体共存或未检测到噬菌体类型分别占12%、21%。由此可见赣南柑橘木虱体内黄龙病菌株中单一的原噬菌体占一定优势,可能是由于2种原噬菌体在寄主中存在竞争。对赣南柑橘木虱黄龙病菌株中噬菌体/原噬菌体类型检测有助于了解该区菌株噬菌体/原噬菌体的遗传多样性,也有助于进一步的研究分析柑橘木虱的传毒机制。 相似文献
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柑橘黄龙病是国内植物检疫对象,明确其地理分布对控制黄龙病扩散具有重要意义.于2008年10～11月赴吉安和抚州可疑黄龙病桔园采集30份病样,其中吉安地区19份,抚州地区11份,采用PCR方法对这30份样品进行柑橘黄龙病菌检测,结果从吉安地区4个病样(遂川县1个、万安县2个、泰和县1个)和阳性对照中扩增到预期的长约700 bp的DNA片段,其他样品和阴性对照中则没有预期的DNA片段产生.选择遂川双桥1号、万安窑头1号和泰和文田4号3个分离物的PCR产物进行纯化、测序,从中各获得一段长为654 nt的序列.经同源性比较发现,这3条DNA序列不仅完全相同,而且它们与已报道的柑橘黄龙病菌亚洲种国内外所有分离物的对应序列的同源性也均为100%,但它们与已报道的柑橘黄龙病菌非洲种核苷酸序列同源性只有79.6%,结果表明上述3个柑橘黄龙病菌分离物均属于亚洲种.柑橘黄龙病菌亚洲种在吉安地区遂川、万安和泰和县存在的发现,希望能引起有关部门足够的重视. 相似文献
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快速检测柑桔黄龙病病原的研究 总被引：13，自引：0，他引：13
应用ＰＣＲ技术对柑桔黄龙病病原ＤＮＡ进行体外扩增,可建立一套快速,准确,有效的检测该病原的方法,研究结果表明：ＰＣＲ技术对柑桔黄龙病病原的检测具有很强的特异性,只有感染了黄龙病病原的样品,ＰＣＲ才呈阳性反应。文章报道了应用ＰＣＲ技术能检测已带病但尚未症状的柑桔黄龙病病株,该检测技术可以对柑桔黄龙病进行早期诊断,及是地控制带病苗木的传播,这对选育无病苗木及病害的综合治理具有很高的应用价值。 相似文献
15.
三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)是一个与原癌基因Ras(Rat sarcoma)相关的基因,在酵母中,该基因编码一个与Ras相关GTP结合蛋白。为了研究以Ypt1基因为分子靶标的致病疫霉菌(P.infestans)检测技术,比较了30种卵菌Ypt1基因的序列,以该序列为靶标设计了1对针对P.infestans的特异性PCR引物Pi1/Pi2。试验结果表明,在供试的55种不同疫霉菌和真菌的144个菌株中,利用这1对引物只能从P.infestans基因组DNA中分别扩增出1条分子量为369 bp的特异性条带,这1对引物的检测灵敏度为100 pg。以疫霉菌Ypt1通用引物Yph1F/Yph2R结合这1对特异引物进行套式PCR扩增,使引物Pi1/Pi2的检测灵敏度提高了10倍,检测到10 pg的基因组DNA。通过套式PCR,引物Pi1/Pi2对游动孢子和卵孢子的检测灵敏度分别为3个游动孢子和1个卵孢子;以Pi1/Pi2引物,分别采用单轮PCR和套式PCR可检测马铃薯发病组织和病田土壤的致病疫霉。以上结果证明Ypt1基因适合作为疫霉菌分子检测靶标。采用以这1对特异引物建立的以PCR技术为基础的分子检测方法,可对田间土壤和发病植物组织中的P.infestans进行快速、灵敏的检测。 相似文献
16.
应用聚合酶链式反应(PCR)方法对福建、广东和海南等地沿海的养殖牡蛎进行包拉米虫、派琴虫和单孢子虫检测.结果表明,这些地区的牡蛎均不同程度地感染这些原虫,经鉴定病原为牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫.根据基因库中奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫的基因序列设计多对特异性引物,检测包拉米虫的引物采用世界动物卫生组织推荐引物,通过对多重PCR反应条件的优化,建立可同时检测这3种原虫的多重PCR方法.运用该方法对样品中的牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫进行扩增,结果得到与试验设计相符的303、480和749 bp 3条特异性扩增条带,对其他贝类病原核酸的扩增均为阴性.多重PCR方法最低能检测到10 pg牡蛎包拉米虫、奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫DNA,表明该方法适用于这3种原虫的快速检测和鉴别诊断. 相似文献
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【目的】调查柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌（CLas）的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR（qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的cDNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计的2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDaV没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2）,经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱（Diaphorina citri）进行绿色防控。 相似文献
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【目的】中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus,SLCCNV）是危害葫芦科作物的主要病毒之一,可侵染南瓜、葫芦、冬瓜、黄瓜、甜瓜、哈密瓜,严重影响葫芦科作物生产。论文旨在探究SLCCNV广东分离物的分子特征、亲缘关系及其致病性,为SLCCNV的防控提供科学依据。【方法】从广东省湛江市雷州市和徐闻县、惠州市博罗县、河源市源城区以及佛山市高明区共采集53份疑似感染菜豆金色黄花叶病毒属（Begomovirus）病毒的葫芦科作物病样,提取总DNA,利用菜豆金色黄花叶病毒属通用引物AV494/CoPR进行PCR检测。选取PCR检测为阳性的样品进行RCA扩增、酶切、克隆及测序,获得各分离物基因组A组分（DNA-A）的全长序列;同时利用背向引物PCR扩增、克隆及测序,获得各分离物基因组B组分（DNA-B）的全长序列。将得到的SLCCNV广东分离物DNA-A和DNA-B全长序列在NCBI中进行BLAST分析,利用SDT1.2软件MUSCLE alignment方法对序列相似性作进一步比较分析,应用MEGA7软件对获得的SLCCNV广东分离物及已报道的SLCCNV分离物进行系统发育分析。采用同源重组技术,构建SLCCNV河源南瓜分离物的侵染性克隆,通过农杆菌介导注射接种南瓜子叶,测定其致病性。【结果】PCR检测结果表明,53份疑似病样中有52份感染了菜豆金色黄花叶病毒属病毒;进一步从南瓜、葫芦、冬瓜以及白瓜4种葫芦科作物病样中分别克隆获得8个SLCCNV广东分离物基因组全序列,DNA-A组分全长大小为2 735—2 739 nt,含有6个ORF,与已报道SLCCNV相同。DNA-B组分大小为2 701—2 721 nt,含有2个ORF,分别编码与病毒运动相关的蛋白BC1和BV1。序列相似性比较结果显示,广东不同分离物DNA-A组分核苷酸序列相似性在94.9%以上,与已报道的SLCCNV其他分离物的相似性在88%以上;所获得的DNA-B组分核苷酸序列相似性在86.7%以上,与已报道的SLCCNV其他分离物的相似性在83%以上。系统发育分析结果显示,8个广东分离物与来自中国广西、河南、海南、越南、泰国、菲律宾、印度尼西亚的分离物亲缘关系近,同属于一个分支,而与来自印度的分离物亲缘关系较远。致病性测定结果表明,接种后15 d（dpi）,接种南瓜植株的新叶开始出现了皱缩症状;30 dpi,接种南瓜植株表现典型的曲叶病症状,PCR检测均为阳性,Western blot检测进一步验证了上述结果。【结论】在广东检测到SLCCNV侵染多种葫芦科作物,SLCCNV是引起广东南瓜曲叶病的病原。SLCCNV广东分离物与广西、海南等分离物亲缘关系近,同属于一个分支,而与来自印度的分离物亲缘关系较远。 相似文献
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文章以黄瓜霜霉菌为材料,采用改良的CTAB方法提取基因组DNA,研究了黄瓜霜霉菌ITS区序列分析中PCR反应体系的各主要成分对检测结果的影响,确立了适宜的退火温度和反应体系。优化后的反应体系(25μL)为:采用引物ITS1/ITS4各40 ng,60 ng DNA模板,2.5 mmol·L-1 Mg2+2.0μL,2.5 mmol·L-1 dNTP 1.5μL,Taq酶1 U。优化的PCR扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃50 s,52.2℃40 s,72℃1.5 min。在这一条件下运行35个循环;72℃延伸7 min。采用此反应体系和扩增程序,对采自黑龙江省不同地区的31份黄瓜霜霉菌基因组DNA进行PCR扩增,均可得到一条约为900 bp的条带。 相似文献
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应用PCR—SSCP技术对我国柑桔主要产区、泰国和法国留尼湾等地收集到的柑桔黄龙病亚洲种病原（Candidatus Liberobacter asiaticus）16S rDNA进行了分析。PCR结果表明,不同的地区的柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA在长度上没有明显区别。进一步的SSCP结果显示,不同地区柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA序列在组成上也没有差异。显示来自不同地区、不同寄主品种的柑桔黄龙病亚洲种种内没有存在明显差异。 相似文献