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1.
根据NCBI上提供的NP24基因(Gen Bank登录号为543979)的序列,设计全长引物,扩增编码区c DNA,通过克隆至中间载体p MD18-T,将类甜蛋白基因NP24插入植物表达载体PBI121,构建超表达载体PBI121-NP24,采用Ca Cl2冻融法将其转入农杆菌EHA105菌株中。酶切鉴定表明,目的基因已经正确地插入到PBI121载体中,超表达载体构建成功。菌液PCR鉴定,超表达载体已转入农杆菌中。 相似文献
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首次从木薯中分离克隆出AGPase 小亚基的基因5’端cDNA序列,最终为进一步成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的cDNA全长序列提供依据。本研究以木薯作为试验材料,设计锚定引物,并根据木薯AGPase 小亚基基因已知序列设计PCR特异引物,利用逆转录引物AUP1 反转录总RNA,然后分离纯化反转录产物,通过对三大酶促反应（逆转录反应,TdT 加尾,巢式及降落PCR技术）的具体改良,并将其与传统方法进行比较。利用改良后方法,首次成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase 小亚基基因5’端cDNA序列。同时,本研究通过对RACE技术的改良与传统方法相比,在操作上更加简单、快速;在序列获得上更加高效;在试验成本上更加低廉。本研究可以高效且快速的成功获得木薯淀粉关键酶AGPase小亚基基因5’端序列,具有一定的实用性及简便性。 相似文献
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花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶.本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因.从花生栽培品种荔蒲大花生基因组中克隆获得编码PEPCase的基因片段(886 bp),其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%,84.37%,81.54%,81.25%,78.71%,说明我们得到PEPCase基因片段较准确.构建的反义表达载体中PEPCase基因由35S启动子所控制,将构建的反义表达载体命名为pBGPEP.为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体. 相似文献
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此研究利用醋酸钠-抗生素加热法从土壤中分离获得1株产晶体的苏云金芽孢杆菌菌株（Bacillus thuringiensis）。通过已知cry1基因设计引物,以分离得到的菌株DNA为模板进行PCR扩增,将克隆到的目的片段进行测序。测序结果表明：该序列与cry1基因同源性达到90%~99%。将该基因连接到植物双元表达载体pBI121中,构建了该基因的植物表达载体,并将阳性重组质粒转化根癌农杆菌EHA105,利用农杆菌侵染子叶节的方法进行大豆的转化。通过初步的PCR验证,成功获得了转基因植株,建立了大豆的转化体系。 相似文献
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菊花DgLsL基因RNAi表达载体的构建及遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
培育少侧枝的标准切花菊品种具有重要的实际意义。本研究利用RNAi的方法抑制菊花侧枝发育相关基因DgLsL基因的表达,以期得到侧枝生长受抑制的转基因植株。从切花菊‘神马’基因组DNA中克隆侧枝发育相关基因DgLsL基因,经过测序分析,将一个413bp长的保守片段连接到植物表达载体pBI121和pFGC5941,构建植物RNAi载体pBI121-R2,并运用农杆菌介导法将其导入切花菊‘神马’。结果:PCR得到的DgLsL基因片段测序后与GenBank上的DgLsL基因比对,DNA序列一致性为99.4%;构建的RNAi表达载体经过PCR和酶切证实外源基因的正确插入;转化后得到了18株抗性植株,PCR结果显示,12株抗性植株为阳性。本试验通过将DgLsL基因干扰片段导入切花菊,获得了转基因植株,以此为基础可进一步选育少侧枝的切花菊品种。 相似文献
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拟南芥WUS基因的克隆及植物表达载体的构建与鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
克隆得到正确的拟南芥WUS基因,成功构建WUS基因组成型植物表达载体和WUS-EGFP融合基因诱导型植物表达载体,分别转化了根癌农杆菌EHA105,并用WUS基因组成型植物表达载体转化橡胶树愈伤组织,得到组织化学检测阳性的愈伤组织,为深入研究WUS基因生理生化功能做准备。用双酶切切下植物表达载体PBI121的35S-GUS片段,将其连接到pCAMBIA2301上成为中间植物表达载体pCAMBIA2301-35S-GUS。提取拟南芥总RNA,通过RT-PCR方法获得WUS基因,经过TA克隆连接到pEASY-T1载体上,再用双酶切切下WUS基因,将其取代pCAMBIA2301-35S-GUS中的GUS片段,形成pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体。同时以质粒pCAMBIA2301-EGFP为模板,PCR获得EGFP,用重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR）获得WUS- EGFP融合基因,经双酶切将融合基因连接到诱导型植物表达载体pER8上,构成pER8-WUS-EGFP诱导型植物表达载体。通过电击转化法将这两个载体成功转入根癌农杆菌EHA105中,经过双酶切检测、PCR检测与测序分析,检测结果皆完全正确,克隆的WUS基因与WUS-EGFP融合基因序列和NCBI上公布的序列也完全一致,说明这两个植物表达载体已经构建成功。另外用pCAMBIA2301-35S-WUS植物表达载体遗传转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,经GUS染色为蓝色,说明愈伤组织转化成功。 相似文献
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番茄转录因子LeMADS-MC正反义植物表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
为进一步阐明转录因子家族MADS-Box对番茄果实成熟的调控途径,本研究利用聚合酶链式反应技术(PCR)从番茄(Solanum lycopersicum)cDNA中克隆LeMADS-MC基因和LeMADS-antiMC基因核心片段,将这2个基因通过酶切分别正向连接到pCAMBIA1300-221载体和反向连接到pCXSN载体中,并用冻融法将重组载体导入农杆菌中。获得的重组载体分别通过PCR及酶切鉴定符合预期结果且测序结果与NCBI同源性高达100%。结果成功构建了适合于番茄农杆菌遗传转化的植物表达载体,为下一步通过LeMADS-MC基因研究果实成熟衰老机理奠定了物质基础。 相似文献
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草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。 相似文献
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《分子植物育种》2020,(16)
木薯块根淀粉葡聚糖链结构是决定淀粉品质的关键因素,可溶性淀粉合成酶Ⅲ(SSⅢ)是调控植物支链淀粉葡聚糖长链合成的关键酶,木薯有两个MeSSⅢ的同源基因MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2。为了研究木薯MeSSⅢ对木薯块根淀粉品质形成的影响,根据MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的保守区段,本研究构建了MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的双基因编辑载体。利用在线软件CRISPR-P v2.0同时设计靶标MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的sg RNA,通过酶切连接构建重组pCAMBIAP1301-Cas9-MeSSⅢ-gRNA质粒。将基因编辑载体转化农杆菌LBA4404后侵染木薯脆性胚性愈伤组织,筛选阳性脆性胚性愈伤组织,并提取其总DNA。通过PCR扩增靶点MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2的区段,并将扩增片段进行Sanger测序,分析其编辑的靶标位点。结果发现MeSSⅢ-1和MeSSⅢ-2靶标位点被成功编辑,本研究有助于进一步获得MeSSⅢ基因突变体,以深入解析该基因在木薯淀粉合成通路中的作用。 相似文献
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马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其RNAi载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
GBSSI是马铃薯块茎中控制直链淀粉合成的关键酶, 为培育高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料, 根据GenBank登录号X58453设计特异引物, 采用RT-PCR技术获得马铃薯块茎GBSSI相似基因, 利用生物信息学相关软件分析, 预测GBSSI相似基因cDNA序列编码的蛋白质结构和功能。结果表明, 克隆的GBSSI相似基因与报道的GBSSI基因序列相似性达到99.78%, 其开放阅读框长1 824 bp, 编码607个氨基酸, 具有许多重要功能位点;三级结构预测结果表明该蛋白具有淀粉合成功能, 基因序列已注册到GenBank, 序列登录号为EU403426。以此基因CDS内542 bp的靶标序列作为干扰区段, 扩增GBSSI的正反向基因片段, 并引入237 bp的内含子序列, 构建由Patatin启动子驱动的具有“正义基因片段gbss A-内含子VP1-ABI3-like protein-反义基因片段gbss B”的植物干扰表达载体pBI121g-PgABI, 将为淀粉合成的进一步研究和高支链淀粉含量或纯支链淀粉含量的马铃薯品种的培育奠定基础。 相似文献
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小麦AGPase胞质型大亚基基因的克隆与表达分析 总被引：2，自引：0，他引：2
从大粒型小麦品种豫教2号中克隆出调控小麦ADPG焦磷酸化酶(AGPase)胞质型大亚基基因(LSU I)cDNA全长。在花后15 d的小麦植株中, 通过半定量PCR法, 发现LSU I基因在叶、籽粒、叶鞘和颖壳中表达量较高, 但在根和茎中表达量较低, 表明在绿色光合功能器官和淀粉合成器官中, LSU I基因量表达较高。比较了LSU I基因在千粒重不同的豫教2号和兰考矮早八两小麦品种籽粒发育过程中的表达差异后, 发现在籽粒形成期, LSU I基因在两品种籽粒内表达相似, 但在籽粒灌浆期和成熟期间, LSU I基因在千粒重较高的豫教2号内表达量明显高于千粒重较低的兰考矮早八, 这个表达差异与两品种间淀粉积累差异趋势相似, 表明LSU I基因的表达量可能与淀粉的积累量密切相关。 相似文献
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采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号籽粒中克隆出颗粒型淀粉合成酶II基因(Granule bound starch syn-thase,GBSSII)部分cDNA片段(1 069 bp)(GenBank登录号:EF221764),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的GBSSII基因有高度的同源性。以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的GBSSII基因的反义表达载体pWM101GBSSIIA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了GBSSII基因的RNAi载体pFGC5941GBSSIIsa,这些载体的构建为研究GBSSII基因的功能打下了很好的基础。 相似文献
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为了克隆掌叶半夏凝集素基因(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA),并对其进行生物信息学分析和亚细胞定位。采用PCR技术扩增掌叶半夏凝集素基因的ORF序列,构建pCAMBIA1300-35S-PPA-e GFP重组载体,导入农杆菌GV3101并在烟草中进行瞬时表达,采用激光扫描共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。克隆获得的PPA基因全长由777个核苷酸组成,编码258个氨基酸,含有3个甘露糖结合位点和2个保守的B-lectin结构域,Gen Bank登录号为KF154981,氨基酸序列登录号为AGV40779。序列比对表明,该序列与天南星、滴水珠、花南星和半夏凝集素的氨基酸序列相似性分别为96%,91%,86%和83%。亚细胞定位的结果表明,pCAMBIA1300-35S-PPA-e GFP融合蛋白在细胞核内无分布,而是点状分布在细胞质膜上。为进一步解析掌叶半夏凝集素基因的结构与功能,开展掌叶半夏凝集素抗病虫害机制的研究奠定基础。 相似文献
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转录因子CBF4诱导型启动子的克隆及功能分析 总被引：4，自引：0，他引：4
根据已有文献及公开的拟南芥基因组序列,利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了转录因子CBF4上游的DNA片断,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同时对其进行初步的功能分析。采用生物信息学方法对这一序列分析的结果显示这一片段具有启动子的特殊结构域;与GUS基因融合构建双元表达载体,转化烟草的组织特异性表达检测可见明显的GUS活性,初步表明所获片断为CBF4基因的诱导型启动子。 相似文献
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以新疆陆地棉品种新陆早19的DNA为模板,克隆了棉花纤维特异启动子GhCesA4,GenBank登录号：EU183119 ,将启动子基因序列克隆到pMD19-T载体中,由载体通用引物M13-47、RV-M 经PCR鉴定获得pMD19-T/GhCesA4重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由1503 bp核苷酸组成,与GenBank中GhCesA4基因启动子序列同源性高达98％。分别用限制性内切酶ClaⅠ和BamⅠ双酶切重组质pMD19-T/GhCesA4和双元植物表达载体pBI121,分别回收pMD19-T/GhCesA4重组质粒中的GhCesA4小片段和pBI121 植物表达载体中缺失CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化、酶切及测序鉴定,获得由GhCesA4驱动报告基因GUS的新型植物表达载体,命名为pBI-GhCesA4 相似文献
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‘秋天火焰’槭类黄酮糖基转移酶（UFGT）基因的克隆及序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
UFGT（类黄酮糖基转移酶）是植物花色苷生物合成途径的最后一个酶。以槭树‘秋天火焰’秋季变色期叶片总RNA为模板,设计简并引物,采用RT-PCR方法,扩增出一条长397bp的cDNA片段,序列分析结果表明,该cDNA片段与GenBank中登录的荔枝、柑橘柚等物种的氨基酸同源性在70%左右,可知克隆到的核苷酸片段为槭树叶片UFGT基因的cDNA片段,Genbank登录号为KC140229。 相似文献