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1.
针对小鼠RAW264．7细胞IRGl基N设计4个RNA干扰靶位,筛选出最佳干扰序列构建shRNA慢病毒载体质粒并包装获得慢病毒颗粒,进而经嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系,实现IRGl基因在RAW264．7细胞基因表达的沉默。并通过布鲁菌l6M株及M5株感染基因沉默细胞对IRGl基因在布鲁菌感染中的作用进行研究。结果表明,慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了IRGl基因的表达,布鲁菌侵染RAW264．7细胞后IRGl基因表达上调。未试验为1RG1基因及相美调控基因抗布鲁菌病作用研究奠定了基础。 相似文献
2.
利用CRISPR/Cas9系统构建敲除Prdx6基因的RAW264.7小鼠巨噬细胞系,为探讨Prdx6与布鲁菌感染及胞内寄生的关系构建细胞模型。针对Prdx6基因的第1外显子设计sgRNA,构建重组表达载体Prdx6-pX459-sgRNA,将重组质粒转染RAW264.7细胞,嘌呤霉素初步筛选。单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。结果表明,在敲除细胞株基因组中存在碱基缺失,导致移码突变。说明成功获得敲除Prdx6基因的RAW264.7细胞系。 相似文献
3.
试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。 相似文献
4.
《家畜生态学报》2021,(6)
为了建立稳定干扰牛β-连环蛋白的牛肾细胞(MDBK)系,针对牛β-连环蛋白基因的mRNA设计3对shRNA引物序列,分别构建shRNA慢病毒干扰载体;将牛β-连环蛋白过表达载体和shRNA载体共转染293T细胞,检测shRNA的沉默效率;将筛选有效干扰β-连环蛋白的shRNA载体进行慢病毒包装,并利用包装好的重组慢病毒感染MDBK细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得单细胞克隆,传代培养后检测β-连环蛋白的表达,获得有效沉默牛β-连环蛋白的稳定细胞系。结果表明,成功构建了牛β-连环蛋白干扰载体pYr-Lvsh-β-CAT1、pYr-Lvsh-β-CAT2、pYr-Lvsh-β-CAT3,均较好地沉默了β-连环蛋白的表达,经嘌呤霉素筛选和Western blot检测获得有效沉默β-连环蛋白的MDBK细胞系。该研究通过β-连环蛋白特异性shRNA慢病毒载体构建了稳定干扰牛β-连环蛋白的MDBK细胞系,为进一步探讨牛β-连环蛋白与病毒的相互作用及其分子机制奠定基础。 相似文献
5.
《中国畜牧兽医》2016,(4)
试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。 相似文献
6.
构建并筛选针对干扰绵羊NYD-SP27基因的shRNA慢病毒载体。使用RNAi Target Sequence Selector软件设计并合成针对绵羊NYD-SP27基因的4条shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及1条阴性对照序列(NC),分别将其连接到载体pLentiLox3.7(PLL3.7)中,得到4个shRNA干扰载体NYDSP27-shRNA及1条阴性对照载体NC-shRNA,同时将构建好的干扰载体及辅助质粒瞬时共转染至HEK-293FT细胞中,收集病毒液纯化后感染SP27-21细胞,48h后用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NYD-SP27相对表达量,将干扰效果最好的载体用于进一步的研究中。结果表明,构建了重组慢病毒干扰载体,并成功包装成干扰慢病毒NYDSP27-shRNA-LV以及用来感染BHK-SP27-21细胞,48h后用实时定量PCR筛选出高效干扰绵羊NYD-SP27的片段NYDSP27-shRNA-1。为进一步研究NYD-SP27基因表达下调对绵羊精子发育的影响奠定了基础。 相似文献
7.
研究结核分支杆菌Rv2031c基因对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分支杆菌Rv2031c的序列设计引物,以结核分支杆菌国际标准株H37Rv株灭活的菌液上清液为模版,扩增Rv2031c基因;克隆至慢病毒表达载体plex-EGFP中,经酶切和测序鉴定后,获得plex-Rv2031c-EGFP重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与辅助质粒共转染至293T细胞中,转染48h后收集慢病毒,并侵染RAW264.7细胞;侵染48h时收集细胞,用流式细胞术检测各试验组巨噬细胞的凋亡率;提取细胞总RNA并反转录成cDNA,PCR检测Rv2031c基因在细胞中的表达情况;同时,使用细胞裂解液提取细胞总蛋白,Western blot检测Rv2031c蛋白表达水平。结果表明,成功构建了Rv2031c的慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP;构建了过表达Rv2031c的慢病毒Rv2031c-lv;感染Rv2031c-lv的RAW264.7细胞的凋亡率为41.8%,而对照组EGFP-lv感染的RAW264.7细胞其凋亡率为30.0%;PCR结果表明Rv2031c在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达;Western blot结果显示Rv2031c蛋白在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达。该研究成功构建了结核分支杆菌Rv2031c的慢病毒表达载体并验证了其对RAW264.7细胞凋亡的影响,为结核分支杆菌在机体内潜伏期感染的药物研究奠定了基础。 相似文献
8.
针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10~7 TU/mL～10×10~7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%～90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。 相似文献
9.
研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。 相似文献
10.
《畜牧兽医学报》2015,(4)
髓性分化因子88(MyD88)作为TLRs/IL-1R信号通路中重要的接头蛋白,在免疫应答和疾病防御中起重要作用,作者拟通过慢病毒介导的RNA干扰技术获得MyD88基因沉默的猪小肠上皮细胞,为致病菌引起肠道疾病机制研究提供有效模型。共构建4个靶向猪MyD88基因的shRNA表达载体和1个MyD88基因高表达载体,通过实时荧光定量PCR方法鉴定瞬时共转染293细胞中MyD88基因转录水平,筛选获得干扰猪MyD88基因效率最高的shRNA表达载体,将其包装成慢病毒载体,用于建立MyD88基因稳定沉默的猪小肠上皮细胞。最终成功获得MyD88基因沉默效率达到69.3%的小肠上皮细胞,达到基因功能分析的要求。MyD88基因稳定沉默猪肠上皮细胞的获得,为猪肠道病原微生物所引起的TLRs/IL-1R信号通路作用机制的研究提供了宝贵材料。 相似文献