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Stadtfeld M Nagaya M Utikal J Weir G Hochedlinger K 《Science (New York, N.Y.)》2008,322(5903):945-949
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【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的CDS片段,构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒,随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒,通过体外转录,获得该4种多能性转录因子的mRNA,并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT-PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码全序列,将该4种基因分别克隆到pMD19-T载体,构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒。然后将pcDNA3.0载体和pMD19-T重组载体双酶切后用T4连接酶连接,构建含有T7启动子的真核表达载体pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒。各重组质粒分别用限制性内切酶XhoI、XbaI单酶切,酶切后质粒模版按照体外转录试剂盒说明体外转录获得各多能性转录因子的mRNA,并对获得的mRNA进行检测,确定其稳定性和浓度。按照脂质体（体积）﹕mRNA（质量）为1﹕1的比例用脂质体2000转染。转染24 h后,利用Western blot技术、间接免疫荧光实验检测徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的mRNA在成纤维细胞中的表达。【结果】①克隆得到的徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码序列全长分别为1 083、962、1 434和1 320 bp,并经TA克隆测序验证,其CDS 序列与绵羊、人、牛和猪等的序列相似性在89%以上;②体外转录获得的4种多能性转录因子的mRNA经脂质体转染徐淮山羊成纤维细胞,在成纤维细胞中均定位于细胞核;③4种多能性转录因子的mRNA在徐淮山羊成纤维细胞中表达的蛋白与预期大小一致,分别为38、34、50和48 kd。【结论】成功克隆了徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因,该4种多能性转录因子的mRNA能够在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达,为进一步研究Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的功能和山羊体细胞的重编程奠定基础。 相似文献
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为筛选出能够维持绵羊类胚胎干细胞(oESC-like)多能性的因子,以oESC-like为材料,在N2B27/CH/bFGF培养体系中,分别加入PD、PD/hLIF、PD/BPM4、PD/hLIF/BMP4,培养细胞8 d,分析绵羊类胚胎干细胞多能性,确定最适培养体系。结果显示:在N2B27/CH/bFGF培养体系添加PD或PD/hLIF后,oESC-like细胞生长较好;所有培养液中oESC-like细胞的AKP染色及多能性候选基因Sox2和Oct4免疫荧光蛋白染色结果均呈阳性;添加PD后,多能性候选基因Oct4与Klf4 mRNA的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),Nestin与Lin28的表达量显著降低(P<0.01),Sox2与c-Myc升高但差异不显著。添加PD/hLIF后,Oct4的表达量显著高于N2B27/CH/bFGF培养体系中的(P<0.01),c-Myc、Klf4、Lin28表达量升高但不显著,Nestin和Sox2表达量降低但也不显著。以上结果表明:在oESC-like培养体系中,添加PD或PD/hLIF可能有利于维持绵羊类胚胎干细胞的多能性。 相似文献
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猪L-Myc基因的分子克隆及在细胞重编程中的应用 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】克隆猪L-Myc基因,并在蛋白水平表达的情况下探索其在细胞重编程中的作用,为深入研究猪L-Myc基因替代c-Myc诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）奠定基础。【方法】先通过NCBI序列比对,采用RT-PCR克隆猪L-Myc基因cDNA,生物信息学分析猪L-Myc基因与人和小鼠的同源性,构建融合表达载体pEGFP/L-Myc-C1,通过载体转染和免疫印记检测猪L-Myc基因cDNA的蛋白水平表达;再将L-Myc基因装入逆转录病毒载体中,分别使用不同的转录因子诱导猪胎儿成纤维细胞（porcine embryo fibroblast,PEF）,通过形态变化和碱性磷酸酶（AP）染色验证猪L-Myc基因在细胞重编程中的作用。【结果】①获得了1 113 bp的猪L-Myc基因cDNA,编码364个氨基酸,理论分子质量为40 kD;②生物信息学分析显示猪L-Myc基因与人和小鼠高度同源;③免疫印记检测结果说明猪L-Myc基因cDNA能够在蛋白水平表达;④细胞诱导试验和AP染色结果显示转录因子Oct4、Sox2、Klf4和L-Myc（OSKL）组合诱导的细胞阳性克隆率明显高于Oct4、Sox2和Klf4（OSK）组合的阳性克隆率。【结论】获得了猪L-Myc基因,并且该基因在蛋白水平表达且在细胞重编程过程中起到了重要的作用。 相似文献
5.
【目的】Sall4是一种锌指结构转录因子,对建立和维持动物多能干细胞具有重要意义。为探索猪 Sall4 的表达和转录调控机制,克隆了猪Sall4启动子,对其进行了功能验证和核心调控区的筛选。【方法】从猪基因组中克隆获得2.1 kb Sall4启动子片段,并构建相应的报告载体;将报告载体pE2.1转染不同种类的细胞,进行细胞特异性表达检测;采用实时荧光定量PCR方法,检测Sall4在猪不同组织和细胞中的表达变化;通过生物信息学方法,分析Sall4启动子上各种关键顺式作用元件和潜在的转录结合位点;将多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b和Smad与Sall4启动子共转染293T细胞,利用双萤光素酶报告系统检测Sall4启动子活性;采用DNA片段缺失的方法,构建一系列Sall4启动子片段缺失报告载体,将缺失片段载体分别转入293T细胞中,并利用双萤光素酶报告系统检测启动子的活性。【结果】Sall4在多能干细胞、生殖细胞和癌化肿瘤细胞中：包括P19、293T、CHO和Hela等细胞中特异性高表达。另外,通过实时荧光定量PCR检测结果显示,Sall4的表达具有明显的组织特异性,其在猪iPS细胞和生殖相关组织,如睾丸和卵巢组织中表达最高,而在脑、心、肝和肌肉等组织中的表达较低,表明该基因与细胞多能性维持具有互作关系。应用JASPAR和GPMiner软件分析发现,Sall4启动子上有TATA box、GC box、CAAT box等顺式作用元件,以及Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b、Stat3和Smad等多能转录因子的预测结合位点。其中,Oct4、Sox2和TGF-beta信号通路因子对Sall4启动子活性有较显著的激活作用,与对照组比较Sall4启动子活性提高了3倍;而Klf4因子对Sall4启动子活性有一定的抑制作用。采用分段PCR的方法,对2.1 kb启动子进行了片段缺失,分别构建了pL2.1、 pL1.0和pL0.5等3个报告载体,检测结果发现,在pL2.1与pL1.0之间相差1 kb左右,但是启动子的活性没有显著差异。载体pL1.0与pL0.5之间多了486 bp片段,启动子活性提高了1倍多。另外,pL0.5的启动子活性与对照组比较提高了8倍。这些结果表明,猪Sall4启动子在-367 至-852 bp和-1 至-366 bp两个区域内存在核心调控区。【结论】克隆了猪Sall4启动子,证明Sall4的表达具有明显的组织特异性;Sall4启动子序列上存在众多潜在的转录因子结合位点和启动子核心调控域,是参与调控 Sall4 表达的重要序列,这些转录因子与Sall4相互作用对Sall4在多能细胞中的表达调控发挥重要作用。 相似文献
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Lin28广泛地表达于早期胚胎中,是重编程的一个重要诱导因子.根据GenBank中公布的猪源Lin28的序列设计合成引物,以猪桑葚胚cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增其编码区全序列.将此克隆片段连接到PMXs表达载体上,构建逆转录病毒载体PMXs-Lin28.在293T细胞中包装携带Lin28基因的逆转录病毒,感染猪如猪胎儿成纤维细胞(Porcine embryonic fibroblasts, PEF).免疫荧光及Real-time结果显示,PMXs-Lin28载体能够介导Lin28 mRNA和蛋白质在猪胎儿成纤维细胞中的高效表达,Lin28基因能够激活Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和c-Myc基因的表达. 相似文献
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Aoi T Yae K Nakagawa M Ichisaka T Okita K Takahashi K Chiba T Yamanaka S 《Science (New York, N.Y.)》2008,321(5889):699-702
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【目的】揭示miRNA-145、Oct4和Sox2基因与早期胚胎细胞表型间可能存在的关联,为阐明miRNA-145调控早期胚胎发育分化的分子机制奠定基础。【方法】利用手术法收集SPF级昆明小白鼠体内生产的2-细胞胚胎和囊胚,采用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小鼠2-细胞胚胎和囊胚中miRNA-145、Oct4和Sox2基因的表达情况。【结果】在小鼠早期胚胎由2-细胞胚胎发育至囊胚的过程中,miRNA-145在囊胚中的表达量显著高于在2-细胞胚胎中的表达量（P〈0.05,下同）,而Oct4和Sox2在囊胚中的表达量显著低于在2-细胞胚胎中的表达量。【结论】miRNA-145基因表达量上调与Oct4、Sox2基因表达量下调是随着小鼠早期胚胎发育分化的进行同时发生。 相似文献
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Molecular coupling of Xist regulation and pluripotency 总被引：2，自引：0，他引：2
Navarro P Chambers I Karwacki-Neisius V Chureau C Morey C Rougeulle C Avner P 《Science (New York, N.Y.)》2008,321(5896):1693-1695
During mouse embryogenesis, reversion of imprinted X chromosome inactivation in the pluripotent inner cell mass of the female blastocyst is initiated by the repression of Xist from the paternal X chromosome. Here we report that key factors supporting pluripotency-Nanog, Oct3/4, and Sox2-bind within Xist intron 1 in undifferentiated embryonic stem (ES) cells. Whereas Nanog null ES cells display a reversible and moderate up-regulation of Xist in the absence of any apparent modification of Oct3/4 and Sox2 binding, the drastic release of all three factors from Xist intron 1 triggers rapid ectopic accumulation of Xist RNA. We conclude that the three main genetic factors underlying pluripotency cooperate to repress Xist and thus couple X inactivation reprogramming to the control of pluripotency during embryogenesis. 相似文献
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诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）是指对体细胞实施特定的诱导方法,将体细胞重编程获得的多潜能干细胞。最常用的诱导方法是利用基因导入技术,将与胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）多潜能性相关基因的转录因子导入体细胞,激活内源多能性基因的表达,实现体细胞重编程。除转基因外,使用某些小分子物质或蛋白质等也可以实现体细胞重编程。iPSC与ESC在形态学、表观遗传学和分化能力上高度相似。由于iPSC来源于普通成体细胞,避免了胚胎干细胞面临的伦理道德和免疫排斥问题,使得这一技术在再生医学和畜牧生产上都具有广阔的应用前景。然而,iPSC的低生成率和高风险性逐渐成为制约该技术发展的主要障碍。生成效率和速率低,大大增加了获得iPSC的难度,工作量大且成本高;高风险性使iPSC无法安全应用于再生医学和生产转基因动物。这成为iPSC科研工作者亟待解决的两大问题。文章介绍了通过抑制体细胞衰老来促进iPSC生成的相关研究进展。该方法对体细胞重编程有显著效果,但同时也存在较大的安全性争议。控制细胞衰老凋亡的Ink4a/Arf位点,p53、pRB、p21等基因和蛋白因子可以及时清除体内损伤细胞,促进细胞衰老凋亡,抑制细胞癌变,组成了维护机体健康的重要调控通路。近年研究表明,抑制促细胞衰老凋亡基因的表达可显著提高iPSC生成的效率和速率,说明肿瘤发生和iPSC生成存在某些相同的调控通路。抑制体细胞衰老的方法主要有3类：改进培养液成分、使用新的转录因子和调节细胞培养环境。通过抑制体细胞衰老,最高可将小鼠iPSC生成效率提高到100%。这为高效获得iPSC,探索iPSC及肿瘤的生成机制提供了新思路。同时,此方法存在较大安全性问题。iPSC最初是由Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc等4种转录因子诱导而来,这些因子本身都存在致癌风险。抑癌基因的失活使获得的iPSC致癌风险增大,成为制约该方法广泛应用的最主要障碍。文章概括了2008年以来通过抑制体细胞衰老促进iPSC生成的研究进展、存在问题和应用前景。 相似文献
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诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）是借助基因导入技术将某些转录因子导入人或动物的体细胞,使体细胞重编程而得到的多能性细胞。iPS细胞来源丰富,研究表明利用不同的载体诱导系统或不同的转录因子组合,多种体细胞都可被重编程为iPS细胞,如成纤维细胞、肝细胞、角质细胞及脐带血细胞等。作为干细胞中新的一员,iPS细胞在克隆形态、基因表达模式、表面标志物、拟胚体形成、畸胎瘤及嵌合体形成（小鼠）、分化能力等方面与胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）非常相似。与胚胎干细胞一样,在特定的诱导条件下,iPS细胞在体外可被诱导分化为多种细胞,如心肌细胞、血细胞、生殖细胞等,进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离,iPS细胞也成为细胞治疗及组织器官再生最有前景的种子细胞,在细胞替代性治疗、发病机理研究及新药筛选方面具有潜在价值。雄性不育不仅影响人类正常健康生活,对畜牧业的发展也极为不利。国内外的研究成果表明,给予适当的诱导物及诱导条件,人和小鼠的iPS细胞体外可被诱导分化为原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）、精子细胞及其前体细胞。这些研究不仅避免了胚胎干细胞研究领域存在的取材困难、免疫排斥和伦理道德等问题,还为揭示雄性生殖细胞的发育机制及研究雄性不育提供了较好的研究平台。由人iPS细胞诱导得到的雄性配子可为患者提供自身的雄性配子产生后代,避免了免疫排斥问题,为未来治疗雄性不育带来曙光。iPS细胞体外诱导分化技术对现代畜牧业发展也具有巨大的潜在应用价值,可进行转基因动物的生产。现从不同的诱导剂、不同的培养条件及iPS细胞体外诱导分化优势等方面,对iPS细胞体外定向诱导分化为雄性生殖细胞的研究进展及应用前景进行综述和展望。 相似文献
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【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）和牛胎儿成纤维细胞（bovine embryonic fibroblast,BEF）,用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA 表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞比单独生长在小鼠或牛胎儿成纤维细胞饲养层的结构致密、与滋养层界限明显;②小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞在1﹕1比例混合下牛胚胎干细胞克隆结构致密、显著堆积且边缘轮廓清晰优于其它比例组合;③获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT4、SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体。【结论】小鼠和牛胎儿成纤维细胞在以1﹕1的比例混合下制成的饲养层可更好地支持牛胚胎干细胞的体外培养,获得的克隆形态最好。 相似文献
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Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons 总被引：3，自引：0，他引：3
Dimos JT Rodolfa KT Niakan KK Weisenthal LM Mitsumoto H Chung W Croft GF Saphier G Leibel R Goland R Wichterle H Henderson CE Eggan K 《Science (New York, N.Y.)》2008,321(5893):1218-1221
The generation of pluripotent stem cells from an individual patient would enable the large-scale production of the cell types affected by that patient's disease. These cells could in turn be used for disease modeling, drug discovery, and eventually autologous cell replacement therapies. Although recent studies have demonstrated the reprogramming of human fibroblasts to a pluripotent state, it remains unclear whether these induced pluripotent stem (iPS) cells can be produced directly from elderly patients with chronic disease. We have generated iPS cells from an 82-year-old woman diagnosed with a familial form of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). These patient-specific iPS cells possess properties of embryonic stem cells and were successfully directed to differentiate into motor neurons, the cell type destroyed in ALS. 相似文献
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【目的】探讨猪类胚胎生殖细胞向神经细胞分化的潜能。【方法】采用性腺-中肾区基质细胞与猪原始生殖细胞共培养的方法得到猪类胚胎生殖细胞,通过直接分化的方法进行神经细胞定向诱导。【结果】（1）与小鼠成纤维细胞作为饲养层相比,性腺-中肾区基质细胞作为饲养层同样能够支持猪类胚胎生殖细胞生长,二者对猪类胚胎生殖细胞的增殖能力不存在显著影响;（2）猪类胚胎生殖细胞有较强的碱性磷酸酶活性,Q-PCR结果显示多能性基因Oct4、Sox2及Nanog表达,增殖能力呈现“S”型,即生长的潜伏期、对数期及平台期,猪类胚胎生殖细胞经体外悬浮培养能够形成拟胚体;（3）经过诱导猪类胚胎生殖细胞能够分化形成表达神经干细胞、神经元及神经胶质细胞标记物的多种神经细胞类型。【结论】从早期性腺中成功分离培养得到了猪类胚胎生殖细胞,通过简单、快速的神经细胞分化的诱导体系证实了猪类胚胎生殖细胞具有体外定向分化为多种神经谱系细胞的能力。 相似文献
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为提高体外胚胎发育质量和体外胚胎建立胚胎干细胞系效率,研究以N2B27为基础的干细胞培养体系对猪孤雌胚胎体外发育和后续建立胚胎干细胞系的影响。设立3个试验组:PZM-3组,孤雌激活的胚胎全程PZM-3培养体系中培养; N2B27组,孤雌激活的胚胎全程N2B27培养体系中培养; PZM-3-N2B27组,孤雌胚胎在PZM-3培养体系中培养至桑葚胚后更换为N2B27培养体系。结果表明,N2B27组无法获得囊胚,但PZM-3-N2B27组胚胎可正常发育至囊胚,囊胚率未显著提高,但囊胚细胞总数显著提高(P<0.05)。PZM-3-N2B27组获得孤雌囊胚用于建立猪胚胎干细胞系,显著提高原代克隆形成率(P<0.05),获得猪胚胎干细胞系呈碱性磷酸酶阳性,表达Oct4、Sox2和Nanog等多能性基因。结果表明,采用PZM-3和N2B27培养体系结合获得的猪孤雌囊胚利于猪胚胎干细胞系建立。研究为进一步优化猪胚胎体外培养体系,获得初始态胚胎干细胞系提供参考。 相似文献
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【目的】研究Activin A对人胚胎干细胞（hESCs）向限定性内胚层（DE）诱导分化的促进作用及其信号通路分子,为hESCs向DE诱导分化体系的优化提供参考。【方法】在人饲养层体系培养的hESCs中,收集100 ng/mL Activin A分别诱导0,6,12,24,48,72,96,120 h的细胞,用实时荧光定量RT-PCR检测原条标记Gsc和Mixl1、中内胚层共同前体标记Brachyury、内胚层标记Foxa2和Sox17、中胚层标记Flk1、外胚层基因Pax6、多能性相关基因Oct4与Nanog表达水平的变化,用细胞免疫荧光检测Brachyury和Sox17蛋白表达水平的变化。【结果】在人饲养层（HEF）培养体系上,高浓度Activin A能更快地促进中内胚层基因的表达并提高其表达水平;Brachyury和Sox17蛋白的细胞免疫荧光检测表明,Activin A诱导12和48 h就可检测二者的表达明显增加,且二者的表达水平分别在诱导48和96 h时达到高峰;hESCs高效分化为限定性内胚层细胞,DE细胞分化率为（81.7±5.4）%,并且体外的内胚层分化过程遵循从原条开始、经过中内胚层共同前体阶段、再到内胚层的发育过程,与体内发育规律相似。【结论】Activin A能特异性地诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层分化,转录调控Brachyury和Sox17蛋白的表达。 相似文献