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1.
异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一,猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体.然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP又称CD47),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除.本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪基础上,转入hCD47基因,制备表达hCD47基因的GTKO/hCD47巴马小型猪,可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬.首先构建巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子(cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin promoter,CAG)调控的hCD47基因表达载体pCAGGS-hCD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,然后通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪.利用PCR对克隆仔猪进行转基因鉴定,通过qRT-PCR、Westem blot和免疫组化等方法分析hCD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织的表达.抽取存活仔猪血液进行生理指标检测,监测其健康状况.通过体细胞克隆技术获得了13头转基因克隆猪,PCR鉴定均为hCD47基因阳性猪.qRT-PCR结果显示,hCD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和心脏.Western blot及免疫组化结果进一步证实hCD47基因在胰腺、肝脏等中均具有较强表达,与qRT-PCR结果一致.血液生理指标显示,存活仔猪健康状况良好.本研究成功制备了表达hCD47基因的GTKO巴马小型猪,确证了hCD47基因在主要器官中的表达特征,将有助于探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应. 相似文献
2.
猪(Sus scrofa)内皮细胞的去唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)是诱发异种肝移植后受体发生血小板减少症的主要诱因之一.本研究在α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除的五指山小型猪基础上,利用规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)结合体细胞核移植技术制备ASGR1基因敲除猪,针对猪ASGR1基因设计并构建了靶向表达载体单链导向RNAl (single guide RNA1,sgRNA1),将sgRNA1与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)质粒共同电转染GGTA1基因敲除猪耳成纤维细胞,流式细胞仪富集筛选带绿色荧光的细胞后培养单细胞克隆.实验结果表明,PCR测序检测培养获得的41个单细胞克隆,37个克隆发生基因突变,ASGR1基因突变效率为90％,其中双等位基因敲除的细胞克隆30个,效率高达73％.选择4个ASGR1基因敲除类型不同的细胞为核供体进行核移植,将早期重构胚移植到4头受体猪,2头妊娠至终期,产仔猪6头,Western blot显示ASGR1基因敲除仔猪的肝脏中没有ASGR1的表达.对sgRNA1的13个潜在脱靶位点,分别设计引物进行PCR扩增和测序,结果显示没有脱靶现象.总之,本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞核移植技术快速高效地制备了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型猪模型,有望解决异种肝移植后出现的血小板减少症,为临床过渡肝的应用研究提供了良好的研究材料. 相似文献
3.
CRISPR/Cas9介导CMAH基因敲除猪创制及繁育分析 总被引：1，自引：0，他引：1
N-羟乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Gc)是引起异种移植排斥反应的重要非半乳糖抗原,由单磷酸胞嘧啶-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)催化生成。本研究以α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)敲除猪为基础,利用CRISPR/Cas9制备CMAH基因敲除(CMAH~(-/-))巴马小型猪(Sus scrofa),并评估其健康及繁育状况。针对猪CMAH基因设计单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)并进行效率验证,敲除效率较高的CMAH-g1电转染巴马猪耳成纤维细胞(ear fibroblasts of Bama mini pigs,BMEF),鉴定为阳性的细胞作为核供体,利用体细胞核移植技术制备CMAH~(-/-)猪。提取仔猪基因组DNA,PCR测序确定突变类型;用Anti-Neu5Gc抗体进行免疫荧光检测确定仔猪器官Neu5Gc表达情况。采集4月龄CMAH~(-/-)巴马猪血液检测其生理指标;CMAH~(-/-)巴马公猪6月龄性成熟后配种,以母猪的产仔数评价CMAH~(-/-)公猪的繁育能力。结果成功获得CMAH~(-/-)巴马猪,有-2 bp/-2 bp和-1 bp/-1 bp共2种纯合敲除类型。免疫荧光检测结果显示在CMAH~(-/-)猪器官表面未检到Neu5Gc表达,表明CMAH基因被敲除。与野生型(wild type,WT)相比,CMAH~(-/-)猪血常规和血生化无显著差异,与CMAH~(-/-)公猪配种的母猪产仔数正常。本研究利用CRISPR/Cas9技术制备了GGTA1/CMAH基因敲除猪,健康状况和繁育能力正常,该猪可为进一步降低异种器官移植急性排斥反应提供低免疫原性供体。 相似文献
4.
血小板-内皮细胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)是内皮细胞表面一种重要的膜分子,常作为特异性标记鉴定内皮细胞.然而,CD31是否可作为纯化猪(Sus scrofa)肝窦内皮细胞(porcine liver sinusoidal endothelial cell,pLSEC)的特异性标记还有待验证.本实验通过CD31流式分选分离纯化pLSEC,观察分离后的pLSEC是否具有标志性的窗孔结构.以α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的五指山小型猪为研究材料,采用胶原酶原位肝脏灌注、离体消化,Percoll梯度离心,异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-CD31标记pLSEC进行流式分选.结果表明,分离得到的pLSEC在倒置显微镜下细胞呈典型的内皮细胞形态,铺路石样排列;通过透射电镜观察到细胞具有窗孔结构,通过环境扫描电镜观察到pLSEC与猪主动脉内皮细胞(porcine arterial endothelial cell,pAEC)细胞表面结构具有明显区别,pLSEC具有特殊的窗孔结构.利用实时荧光定量PCR检测pLSEC、pAEC和猪耳成纤维细胞(porcine ear fibroblast cell,pEFC)的CD31、细胞粘附因子(cell adhesion molecules,CD146)、血友病因子Ⅷ基因(hemophilia factorⅧ,Ⅷ-F)、血管性血友病因子基因(von willebrand factor,vWF)的表达.结果表明,pLSEC的CD31、CD146、Ⅷ-F和vWF表达量显著高于pAEC和pEFC.利用免疫荧光法检测到pLSEC具有摄取细胞膜红色荧光探针(1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate,DiI)标记的乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein,Ac-LDL)的内吞功能.总之,利用CD31分离纯化的pLSEC,具有典型窗孔结构和内吞功能,同时高表达CD146、Ⅷ-F和vWF等肝窦内皮细胞的标记分子,为进一步研究异种肝移植的血小板减少症的问题提供了良好的细胞材料. 相似文献
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以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)生长激素基因AmGH构建到植物表达载体pCAMBIA13011-GH上,用根癌农杆菌(Agrobacterium turaefacicas)GV3101介导转化烟草(Nicotiana tabacum)无菌叶片外植体,经过两轮潮霉素(hygromycin,Hyg)筛选,从50株再生植株中筛选到12株抗性植株,经GUS组织化学检测和PCR鉴定,其中4株为阳性,表明AmGH基因已成功地转化并整合到烟草基因组中,RT-PCR检测表明,大熊猫生长激素基因AmGH已在转基因烟草中表达.这是首次报道大熊猫生长激素基因在植物系统中表达. 相似文献
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克隆了鸡(Gallus gallus)的γ-干扰素cDNA，并用大肠杆菌(Escherichia coli)进行了温度诱导型表达。用PCR方法扩增了鸡γ-干扰素基因组基因，将其克隆到载体pGEM-T上。对重组载体的插入片段进行酶切分析和部分序列测定：证明了基因的正确性；克隆的鸡γ-干扰素基因的编码序列中存在一个点突变(G→A)，这一突变导致一个三联体密码子GAA变为AAA，编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)。用鸡γ-干扰素基因组基因构建了真核表达载体pCI-ChIFN。将这一真核表达载体转染兔成纤维细胞的细胞系中进行表达实验：提取转染后细胞裂解物中的RNA，再以此为模板进行RT—PCR，获得了完整的鸡γ-干扰素cDNA基因，同时证明鸡γ-干扰素基因组基因能在兔成纤维细胞系中表达。用鸡γ-干扰素cDNA构建了温度诱导型原核表达载体pBVcDNA，并将其转导到大肠杆菌DH5α中，经细菌发酵和温度诱导，表达了一个18kD的特异蛋白，其表达量占细菌总蛋白的8．75％。 相似文献
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腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK),在真核细胞生物中广泛存在,是调控机体能量代谢的关键酶.本研究旨在构建并筛选猪(Sus scrofa)AMPKα基因的有效siRNA干扰载体,并探讨AMPKα基因对脂肪分解关键酶基因表达的影响.根据猪AMPKα基因(GenBank登录号:NM-001167633)全长cDNA序列,设计合成其特异性发夹siR-NA干扰片段,将其克隆插入pSilencer 4.1-CMV neo Vector干扰载体中,构建猪AMPKα基因的siRNA真核表达载体RA1和RA2,并通过PCR、双酶切和测序对其进行鉴定.构建成功后转染猪肌内脂肪前体细胞并检测其干扰效果及对脂肪分解关键酶一一激素敏感脂肪酶(hormone sensitive lipase,HSL)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)和肉毒碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyl transferase,CPTl)基因表达的影响.结果表明,所构建的猪AMPKα基因的特异性siRNA表达载体RA1和RA2均可降低猪AMPKα mRNA表达(P＜0.05),而且RA2干扰效果优于RA1.用RA2干扰AMPKα后,猪肌内脂肪前体细胞中AMPKα及脂肪分解关键酶HSL、ATGL和CPT1基因表达量显著下降(P＜0.05).提示,抑制AMPKα基因表达后,猪肌内脂肪前体细胞中脂肪分解和脂肪酸氧化速率降低.本研究结果为深入探讨AMPKα对猪脂肪代谢的影响机制及通过营养调控基因表达进而调控猪体脂沉积提供基础资料. 相似文献
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NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应（overlapping PCR）法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆（golden gate）方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。 相似文献
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应用衔接头PCR技术，以蓝猪耳全基因组DNA分别经DraI、EcoRV、PvuII、SmaI消化后与衔接头连接产物为模板，用衔接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR，先后克隆到两个大小为798bp、813bp的TfPLC1基因上游序列；经测序、blastn比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1基因的启动子序列，共1432bp。序列分析表明它含有类似于TATA box和CAAT box的元件，在其远端上游区域还有多个AT富含区，而且还含有多个胚乳特异表达启动子的元件。将该启动子全序列和5’端缺失的700bp序列与PBI121分别构建了植物表达载体PPP1326和PPP700，用于转化蓝猪耳，以验证该启动子的功能。该启动子的克隆对于研究蓝猪耳胚珠TfPLC1基因的表达调控及功能具有重要意义。 相似文献
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克雷伯氏菌1,3-丙二醇氧化还原酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达 总被引：4，自引：0，他引：4
以基因组DNA为模板,利用PCR技术从克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中扩增得到含有1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的DNA片段,将其定向连接到克隆质粒pGEM-3xf上,得到重组质粒pGEM-dhaT。将此重组质粒转化到受体菌Escherichia coli DH5α中,通过蓝白斑鉴定挑选出阳性菌株。DNA序列分析表明其基因全长为1185bp。将该片段插入表达载体pSE380,构建成重组子pSE-dhaT,并在E．coli JM109中获得表达,经SDS-PAGE检测,表达产物分子质量与天然纯1,3-丙二醇氧化还原酶(DHAT)相同,约为43ku。 相似文献
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分别以鸡白细胞介素18成熟肽基因(mChIL-18)和鸡α-干扰素成熟肽基因(mChIFN-α)为模板,通过PCR及PCR重叠延伸技术(SOE)得到融合基因mChIL-18mChIFN-α。将融合基因克隆于pGEM-T Easy载体后,再亚克隆到原核表达载体pQE30,并进行测序。测序结果表明获得了阅读框完整、连接部位正确的融合基因mChIL-18mChIFN-α。SDS-PAGE可检测到分子质量为39.4kD的重组蛋白,Western blot证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。 相似文献
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应用衔接头PCR技术,以蓝猪耳(Torenia fournieri)全基因组DNA分别经DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和SmaⅠ消化后与衔接头连接产物为模板,用衔接头引物和TfPLC1基因的特异引物经过多轮的巢式PCR,先后克隆到2个798和813bp的Tf-PLC1基因上游序列;经测序、blast比较分析和拼接得到一个蓝猪耳TfPLC1基因的启动子序列,共1432bp。序列分析表明它含有类似于TATAbox和CAATbox的元件,在其远端上游区域还有多个AT富含区,而且还含有多个胚乳特异表达启动子的元件。将该启动子全序列和5'端缺失的700bp序列与PBI121分别构建了植物表达载体PPP1326和PPP700,用于转化蓝猪耳,以验证该启动子的功能。 相似文献
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朱睦元 《农业生物技术学报》2008,16(1)
植物反应器生产药品成本低,具有改变传统制药方法的光明前景。本研究 以PCR法克隆的大熊猫生长激素基因Am-GH,构建了原核表达载体pEGX-AmGH和植物表达载体pCAMBIA13011-GH。pEGX-AmGH转化E. coli得到高效表达。pCAMBIA13011-GH通过根癌农杆菌GV3101的介导转化烟草无菌叶片外植体,经过四轮潮霉素(Hygromycin, Hyg)递增筛选,获得抗性植株。其中部分Hyg抗性植株经GUS和PCR检测为阳性。鉴定结果表明Am-GH 已成功整合到烟草基因组中。为进一步探讨大熊猫生长激素基因Am-GH在烟草中的表达奠定了基础。 相似文献
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一种新的猪α-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达 总被引：8，自引：0，他引：8
提取经新城疫病毒诱导培养的猪外周血白细胞总RNA,RT-PCR扩增出猪α-干扰素基因并克隆到T载体.测序结果表明,扩增片段含有信号肽的猪α-干扰素完整基因,与GenBank上登录的猪α1-干扰素基因同源性为97.2%.亚克隆猪α-干扰素成熟蛋白编码基因并对其5'段前1个稀有密码子进行大肠杆菌(Escherchia coli)偏嗜性改造.构建了猪α-干扰素原核单纯表达载体pCIFNA,实现了猪α-干扰素在大肠杆菌中的表达,表达产物约占菌体总蛋白的15.6%.表达产物以包涵体形式存在,用含6 mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后,细胞病变抑制法测定结果表明,重组猪α-干扰素具有较高抗病毒活性,约为1.66x106U/mg. 相似文献
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应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。 相似文献
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生理条件下,血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)可与凝血酶结合成复合物,该复合物既可通过激活蛋白C达到抗凝和促纤溶作用;又可经内皮细胞胞吞,通过细胞内溶酶体降解、清除体内凝血酶。另外,TM可与凝血因子Xa特异性结合,抑制凝血酶原的活化,进而使凝血酶的生成速率明显降低。移植后,猪(Sus scrofa)的血管暴露在人(Homo sapiens)血液中,猪TM无法与人的凝血酶发生结合从而使凝血功能紊乱,因此,在猪体内表达人TM是目前解决凝血功能异常的一个新的思路。本研究制备了血管内皮特异性表达人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的转基因克隆猪,研究了hTM在五指山小型猪血管内皮细胞表达情况。利用Red重组系统从细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)上抓捕获得猪的内源TM启动子。PCR扩增获得hTM的c DNA及牛生长素Poly A(b GHp A)序列,依次酶切连入p Blue ScriptⅨSK(-),构建血管内皮特异性表达hTM的载体。获得的载体p BS-hTM-puro经XhoⅨ线性化,电转染五指山小型猪胎儿成纤维细胞,经1.0μg/m L嘌呤霉素筛选10~15 d得到339个转hTM基因的阳性克隆,取两个生长较好的克隆用于核移植,随后获得重构胚972枚。胚胎移植后产仔猪5头;其中4头经基因组DNA、组织RT-PCR检验为阳性,Western blot结果显示hTM为血管内皮细胞特异性表达。成功获得可特异性表达hTM转基因细胞系及转基因克隆猪,为解决异种器官移植后出现的凝血紊乱问题提供了资料基础。 相似文献
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利用Cre/loxp定位重组系统构建雄性不育基因和恢复基因表达载体 总被引：4，自引：0，他引：4
结合Cre/lox定位重组系统和杂种一代的育种特点，构建了反义肌动蛋白雄性不育基因表达载体pCABARTAAct和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre。将位于质粒pSTAAct中的反义肌动蛋白雄性不育基因表达盒(含TA29启动子、反向插入TA29启动子下游的Actin基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp两个同向lox位点之间，再将上述表达盒连同lox位点切下插入pcAMBar，获得以除草剂Basta为筛选剂的反义肌动蛋白雄性不育基因表达载体pcABARTAAct。PCR方法从溶原菌BM25．8基因组DNA扩增出Cre基因，克隆测序验证无误后插入PBl525 CaMV35S-35S双启动子和Nos终止子之间，再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点，得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre。 相似文献