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1.
本实验研究了大黄鱼肌肉生长抑素前肽基因对红鲤的促生长作用。分别通过RT-PCR和PCR从大黄鱼(Larimichtys crocea)和pIRES-EGFP质粒扩增得到了肌肉生长抑素(MSTN)前肽基因及核糖体内部进入位点序列(IRES)-增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)片段,经测序验证正确后,构建了Tol2转座子供体质粒pT2AL200R150G-MSTN propeptide-IRES-EGFP。通过精子介导法(S1、S2组)、电穿孔法(E1、E2组)及基因枪法构建转基因红鲤(Cyprinus carpio),孵化72h后的鱼苗经荧光显微镜检测,EGFP表达阳性率为:精子介导法S1组38%,精子介导法S2组48%,电穿孔E1组47%,电穿孔E2组53%,基因枪组2%;孵化10d的仔鱼RT-PCR检测EGFP和MSTN前肽基因阳性率为:精子介导法S1组35%,精子介导法S2组45%,电穿孔E1组45%,电穿孔E2组55%,基因枪组1.8%。孵化后75d转基因红鲤与对照组相比,体长和体重分别提高了21.31%和27.59%。本实验结果表明,精子经高渗、低渗保存剂处理并通过电穿孔作用可大幅提高基因转移效率。 相似文献
2.
在构建玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)基因家族表达载体的过程中,因为表达载体可供选择的多克隆位点较少,且有些还与目的基因同源,所以采用转移PCR(T-PCR)扩增技术替代通常的酶切连接方法。为避免错误连接或未连接的第一轮T-PCR中间产物对退火温度不同的第二轮扩增循环产生干扰,本研究对T-PCR接头引物3'-端和5'-端的两段序列及其退火温度、引物、供体质粒和目标质粒模板的浓度,特别是温度循环程序进行设计和筛选,并用扩增构建的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,进行菌液PCR和测序验证。结果表明,在两条引物3'-端序列理论退火温度相差不大的情况下,T-PCR第一轮扩增的退火温度以低于或接近其中较低的理论退火温度为宜。但在两条引物3'-端序列理论退火温度相差较大的情况下,则应高于其中较低的理论退火温度。T-PCR第二轮扩增的退火温度,适当低于两条引物理论退火温度的平均值。按优化的温度循环程序,从供体质粒pMD19-T扩增ZmSnRK2基因家族8个成员的编码序列,并整合到目标载体pHBT95启动子下游特异位点,重组率达60%以上。综上表明,T-PCR对没有适用多克隆位点的载体构建的实用性较强。本研究通过优化的温度循环程序为表达或诱变载体构建提供了一定的理论参考。 相似文献
3.
由芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)引起的病毒病是大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)主要病害之一。大白菜中野生型eIF(iso)4E.a(A)和eIF(iso)4E.c(C)共同介导病毒的早期侵染,单个或两个基因发生功能缺失突变将使病毒难以侵染植株,大白菜表现为抗病毒表型。前人已筛选出eIF(iso)4E.a的可变剪切突变(a~1)和假基因突变(a~2)、eIF(iso)4E.c的移码突变(c~1)和转座子插入突变(c~2)。本研究对3种eIF(iso)4E.a等位基因序列进行了重新分析和评估,优化了检测标记,结合本课题组已经获得的鉴定eIF(iso)4E.c等位突变的标记,对中国市场销售的38个大白菜品种和本课题组创制的96份叠抱类大白菜种质资源进行了筛查。结果表明,A、a~1和a~2基因型在市售大白菜杂交种和叠抱类种质资源中的检出频率分别是36.8%、40.8%、22.4%和26.1%、28.1%、45.8%。a1和a2两种突变等位基因的检出频率总体达71.3%。相比之下,在eIF(iso)4E.c位点,供试的134份材料中仅有1份种质是c~1c~1基因型、13份种质是c~2c~2基因型,两种突变等位基因所占的比例仅为10.4%。本研究结果为利用抗病毒功能基因进行种质鉴定和新品种培育提供了可选的标记,对已有品种的推广提供了抗病毒分子证据。 相似文献
4.
多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究 总被引：1，自引：0，他引：1
在转基因动物的研究中,一般采用随机插入的方法。基因在受体动物的基因组中随机整合,严重制约了转基因动物外源基因的稳定遗传,是转基因动物研究亟待解决的问题。转基因定点整合技术,即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径,但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小组已建立了体外动物细胞的多位点基因打靶技术,并构建了用于鳜鱼的体内多位点基因打靶的打靶载体,本文开展多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究。以鳜鱼rDNA基因(编码rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含干扰素基因的打靶载体,以其间隔序列为靶位点,针对鱼类胚胎发育特点,采用精子介导技术进行多位点基因打靶,最终获得定点整合干扰素基因的鳜鱼,并建立一套适用于动物的基因定点敲入的体内基因打靶技术。主要研究内容如下:(1)采用组织培养方法,获得鳜鱼头肾淋巴细胞和脾淋巴细胞,采用脂质体介导法使多位点基因打靶载体在鳜鱼的细胞上实行基因转移。采用正负筛选方法,利用筛选药物G418和GCV(更昔洛韦)筛选转染后的细胞两周后,对存活细胞进行DNA水平和RNA水平鉴定。结果证明了干扰素基因在鳜鱼细胞上实现了定点整合和稳定表达。(2)利用精子介导法将经线性化处理后的多位点基因打靶载体在鳜鱼的胚胎上实行基因转移。(3)根据靶位点定点整合的正负筛选原理,利用筛选药物G418和GCV筛选与富集定点整合后的阳性鱼胚或鱼苗,结果成功孵化出106尾转基因鳜鱼鱼苗。(4)培育6个月后,取20尾转基因鳜鱼进行鉴定。采用PCR、RT-PCR、测序等方法进行定点整合的鉴定。结果表明:6尾检测到已转入的基因——干扰素基因,其中有3尾实现了定点整合并表达。本研究率先将多位点基因打靶技术应用到转基因鱼的研究中,建立一套适用于鱼类的高效、安全的多位点基因打靶技术,并获得外源基因定点整合并表达的鳜鱼。 相似文献
5.
为了在昆虫细胞中表达猪圆环毒病2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)衣壳蛋白,本研究设计合成引物从临床病料中扩增获得猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)山东株衣壳蛋白基因缺失核定位区的序列,并进行序列分析.将该片段克隆到杆状病毒供体载体pFastBac-1上,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH 10-Bac感受态细胞,获得重组穿梭杆粒,将该杆粒转染到sf9昆虫细胞中,观察重组杆状病毒致细胞病变效应,并采用PCR、间接免疫荧光实验、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot鉴定衣壳蛋白的表达情况.结果表明,扩增获得的猪圆环病毒山东株属于PCV2d亚型,与我国目前使用的商品化疫苗株(PCV2a及PCV2b亚型)在160～180 aa抗原位点有差异.成功构建了重组供体质粒pFastBac l-PCV2d-Cap和重组穿梭杆粒Bacmid-PCV2d-Cap,获得的重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了约24 kD的PCV2d-Cap,该蛋白可以与猪圆环病毒阳性血清及His标签抗体发生反应,证明具有良好的反应原性.本研究是我国首次采用杆状病毒系统表达PCV2d亚型衣壳蛋白,为制备PCV2d亚单位疫苗以及酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、防范PCV2d亚型流行提供了理论依据. 相似文献