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1.
木霉的纤维素酶系中通常缺少β-葡萄糖苷酶,导致了终产物抑制,木霉生长速度明显没有青霉快,因此,来源于青霉的纤维素酶受到了越来越多的重视.通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术从草酸青霉(Penicillium oxalicum)M菌株中克隆得到外切葡聚糖酶基因cbh1(GenBank登录号:HQ843504).该基因全长为1 641 bp,无内含子序列,编码547个氨基酸,具有Glu236,Asp238和Glu241典型催化残基,推测属于糖基水解酶第7家族.将cbh1克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达质粒pPIC9-cbh1,电击转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115菌株.阳性重组子经测序及活性分析表明,cbh1基因成功分泌表达,表明来源于草酸青霉的外切葡聚糖酶基因首次在毕赤酵母中获得成功表达.重组酶活性分析表明,其活性可达56IU/mg,最适反应pH、温度分别为6.0和55℃,且pH和温度稳定性均较好.研究结果认为,cbh1基因的克隆丰富了纤维素酶的基因资源,其在毕赤酵母中的成功表达也为该类纤维素酶基因高效工程菌株的构建提供了基础. 相似文献
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本研究以一株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的弹性蛋白基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%。将弹性蛋白酶基因连入到表达载体pPIC3.5K中,经过酶切和测序鉴定证实弹性蛋白酶基因已插入到载体启动子下游,成功构建了质粒pPIC3.5K/PAE。将pPIC3.5K/PAE线性化,通过电转化将目的基因转入毕赤酵母KM71中,利用MD培养基筛选到近400个转化子,再经G418抗性的筛选,获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子并用PCR和弹性蛋白平板验证。经过甲醇诱导表达得到高表达的重组酵母菌株,酶活为1060U/mL是出发菌株的26倍。本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础。 相似文献
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抗菌肽基因在毕赤酵母中分泌表达及其条件优化 总被引：1，自引：0，他引：1
用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽cecropinA(1-8)-melittin(1-18)基因片段,合成片段与酵母表达载体pPIC9K重组,构建胞外分泌表达载体pPIC9K-came,电击法转化毕赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168宿主菌,对CAME抗菌肽重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明,酵母表达抗菌肽具有抗菌活性且溶血活性显著降低;重组酵母在含2%葡萄糖pH7.0的YPD培养液中,250r/min震荡培养24h后,重组酵母菌的A600为6.0时,经0.5%甲醇在28℃条件下诱导48h能够诱导产生较高抗菌活性的抗菌肽。 相似文献
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弹性蛋白酶基因(PAE)的克隆及在毕赤酵母中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以1株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(P.acruginosa elastase,PAE)基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%.成功地构建了重组表达载体pPIC3.5K/PAE,莺组质粒Sac Ⅰ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71中,通过PCR和表型鉴定表明,PAE基因已经整合到毕赤酵母染色体上.经大量筛选获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子.在甲醇诱导下,经过毕赤酵母高密度发酵进行PAE的表达,经SDS-PAGE分析.结果表明,在培养基上清中含有一明显特异性蛋白条带,大小为34kD.活性检测结果,酶活为1 060 U/mL,是出发菌株的26倍. 相似文献
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里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要：以里氏木霉（Trichoderma reesei）RNA为模板，采用RT-PCR扩增的方法获得不带自身信号肽man1基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pPIC9K-man1，重组质粒SacⅠ线性化后用PEG（聚乙二醇）法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中，通过PCR和表型鉴定表明man1基因已经整合到毕赤酵母染色体上。经大量筛选，获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株RMAN23。将此菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵，测定酶活最高达470IU /mL，同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。 相似文献
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芥菜新型几丁质酶基因在酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达 总被引：3，自引：0，他引：3
BjCHI1基因是从芥菜（Brassica juncea)中克隆的1个新型几个质酶基因，编码含2个几丁质结合域的几丁质酶，本研究曾试图在大肠杆菌中表达该基因而未成功，因此试在酵母中表达，按照BjCHI1cDNA全序列设计特异引物，通过PCR扩增获得成熟肽第1密码子至最后密码子之间的片段，克隆到载体pPIC9K上，测序验证无误后，转化酵母KM71，获得6个抗1.0mg/mL遗传霉素（G418）水平的阳性转化子，PCR鉴定表明外源基因已经整合到酵母染色体上，此6个菌株经初步诱导，均表达出预期的蛋白质，对其中表达效率相对较高的KM71-17-1菌株作进一步的诱导表达，结果表明在诱导第3天后产生的外源蛋白达最大值，至此，成功地获得了BjCHI1蛋白，为进一步研究奠定了基础。 相似文献
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益母草抗菌蛋白LJAMP2的表达及抗菌活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
LJAMP2是一种分离自益母草(Leonurus japonicus Houtt.)种子的非专一性脂转移蛋白类抗菌蛋白.将编码成熟的LJAMP2蛋白的基冈(GenBank Accession No.AY971513)插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pas-toris)表达载体pPIC9K中;重组质粒pPIC9K-LJAMP2经线性化后,用电转化法导入毕赤酵母菌株GS115(his-/mut+)中.转化子用含1.75 mg/mL G418的YPD平板筛选获得多拷贝Mut+转化子.将1%甲醇诱导LJAMP2表达后的发酵液,经进一步浓缩、凝胶过滤脱盐、CM FF阳离子交换色谱和反相HPLC进行纯化,获得纯度90%以上的LJAMP2菌株诱导24 h即有LJAMP2的表达,诱导168 h表达量达到最高;表达的LJAMP2蛋白对黑曲霉(Aspergillus niger)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、镰刀菌(Fusarium graminearum)真菌表现出抑制活性. 相似文献
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采用酵母偏爱密码子合成五条编码猪IGF-I基因的引物，利用重叠PCR技术拼接获得长度为210bp的猪IGF-I成熟蛋白基因。将该基因插入分泌表达载体pPIC9K中，转化巴斯德毕赤酵母菌。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌，以1.5%甲醇诱导培养后，经SDS-PAGE检测表达产物，在7.5 kDa处出现一特异蛋白条带，目的蛋白表达量达410mg/L。Dot blot检测表明，重组蛋白可与抗IGF-I多克隆抗体反应。 相似文献
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拟南芥Alpha-dioxygenase2(AtDOX2)在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了获得具有生物活性的拟南芥(Arabidopsis thaliana)alpha-dioxygenase2(AtDOX2),将其对应基因AtDOX2编码区克隆到酵母表达载体pPIC9k中,获得重组表达载体pPIC9k-AtDOX2,将线性化的重组载体电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达菌株GS115,经G418筛选、PCR鉴定和甲醇诱导时间优化,获得重组AtDOX2的高效表达菌株GS115/pPIC9k-AtDOX2。SDS-PAGE分析结果显示,0.5%甲醇诱导96h重组蛋白表达量最高,其表达量占胞外总蛋白的15%。重组AtDOX2的表观分子量约为70kD,经Ni-NTA柱亲和层析可获得纯度大于80%的重组蛋白。2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)法测定结果表明重组蛋白具有过氧化物酶活性,且其活性受Ca2+和Mg2+激活,受EDTA、咪唑和Mn2+抑制;2,4-二硝基苯肼(2,4-DNP)法测定结果显示,重组AtDOX2具有双加氧酶活性,Ca2+对其双加氧酶活性也有激活作用。结果说明利用酵母表达系统获得... 相似文献
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巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPICINU是利用来源于克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶基因信号肽DNA序列（ISP）构建的。表达实验结果表明，带有分泌表达载体pPICINU的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌，具有与带有表达载体pPIC9K(带有α因子信号肽）的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率。 相似文献
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疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶基因（gla）的克隆及在毕赤酵母中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces laltltginosus)cDNA为模板,克隆了糖化酶基因(gla),序列分析表明gla的开放阅读框由1854个核苷酸组成,编码617个氨基酸.根据氨基酸序列推算该酶的分子量为64 kD,属于糖苷水解酶第15家族,具有该家族催化保守区的典型特征.PCR扩增gla的成熟蛋白编码基因,构建表达载体,经线性化后电击转化导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115),并成功进行了表达.重组酶经摇瓶发酵后酶活可达11.6 U/mL,经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为67kD,比推测的蛋白分子量稍大,可能与该蛋白的糖基化有关.该重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,该酶具有较高的热稳定性,70℃保温20 min后剩余酶活为54%. 相似文献
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分别通过增加CBHⅡ和EGⅣ催化结构域的方式对里氏木霉QM9414外切型葡聚糖酶Ⅱ进行基因重构。第一种重构方式是在CBHⅡ基因的上游增加EGⅣ的催化结构域基因，第二种重构方式是在CBHⅡ基因的下游增加其自身的催化结构域基因。通过PCR和基因重构手段获得重组质粒pPICZαA -cdE –cbh2和pPICZαA- cbh2-cdC，并在毕赤酵母GS115中表达，获得重组菌株P.pastoris PEC11和P.pastoris PCC16，在经改良的摇瓶培养条件下能表达具有较高CMCNa酶活性的融合蛋白，培养液的CMC活性分别达到3.87U/ml和7.66U/ml，其中P.pastoris PCC16表达的重构酶活性是毕赤酵母表达的单一CBHⅡ酶活性的2倍。表明采用增加结构域的方式可以有效提高纤维素酶的活性。 相似文献
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美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 总被引：6，自引：0，他引：6
摘要：从美洲商陆（Phytolacca americana）叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总RNA,经RT-PCR扩增出缺失突变型抗病毒蛋白PAP基因,将该基因克隆于分泌型真核表达载体pPIC9K,然后导入毕赤酵母(Pachia pastoris )菌株GS115细胞。在甲醇的诱导下,经过酵母高密度发酵进行PAP的表达,经SDS-PAGE分析。结果表明,在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为34 kD,经Western-blotting分析,该蛋白与法国PAP抗血清有特异性反应,体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵染性具有高度的抑制性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达。 相似文献
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Gelatin is a well-known biopolymer, and it has a long history of use mainly as a gelling agent in the food industry. This paper reports a new method for producing recombinant hydroxylated human-derived gelatin in Pichia pastoris KM71. Three independent expression cassettes encoding for specific length of gelatin, prolyl 4-hydroxylase (P4H, EC 1.14.11.2), α-subunit (αP4H), and protein-disulfide isomerase (PDI) were individually cloned in one expression vector, pPIC9K. The modified gelatin gene and two subunit genes of P4H were under the control of two different inducible promoters, namely, alcohol oxidase 1 promoter (PAOX1) and formaldehyde dehydrogenase 1 promoter (PFLD1), respectively. The results of sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis show that a recombinant gelatin was successfully expressed in P. pastoris KM71 by methanol induction. Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry analysis indicates that the expressed gelatin was hydroxylated with approximately 66.7% of proline residues in the Y positions of Gly-X-Y triplets. The results of nuclear magnetic resonance spectroscopy of recombinant gelatin test show that the (1)H and (13)C spectra have many corresponding characteristic displacement peaks, and amino acids composition analysis shows that it contains hydroxyproline and its UV absorption is consistent with the characteristics of gelatin. 相似文献
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本研究从哈茨木霉（rrichoderma harzianMm）A25—2总RNA中利用RT—PCR的方法扩增到其纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列,并对该基因编码的氨基酸序列进行分析,得到cbhI基因中编码催化功能域的序列。将催化功能域编码序列克隆到表达载体pCP—GH中,用PEG—CaCl2介导的原生质体转化方法将重组质粒转化到绿色木霉（Trichoderma viride）HP35—3中,筛选得到12个转化子。以P-NPC为底物,测定了该12个转化子的酶活力,获得比活力最高的转化子Tv／CDHI-CBM-5,其纤维二糖水解酶活力是HP35—3的3．8倍。SDS—PAGE分析表明,绿色木霉表达了导入的含A25—2纤维二糖水解酶I催化功能域的编码序列。 相似文献
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草鱼leptin基因的分离鉴定及在巴斯德毕赤酵母中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR技术扩增出草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的leptin基因,将leptin基因克隆至真核表达载体pPIC9K,电穿孔转化GS115菌株,经G418筛选和甲醇诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳和Westernblot分析。结果表明,草鱼leptin基因cDNA序列由438个核苷酸组成,编码146个氨基酸组成的多肽(GenBank登陆号AY551335),与鲤鱼(Cyprinuscarpio)leptin基因相比,核苷酸和氨基酸的同源性为99%;与人、猪和鼠相比,核苷酸同源性分别为84%、86%和95%,氯基酸的同源性分别为84%、82%和96%;与河豚(Takifugurubripes)相比,氨基酸具有较大的差异,仅有9%的同源性,表明leptin在物种的进化上具有一定的差异;实现了草鱼leptin基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)中的表达,表达蛋白的分子量约为16kD,Westernblot分析表明,表达产物具有一定的免疫学活性。 相似文献