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1.
菌株FB是1株对小菜蛾Plutella xylostella幼虫具有高毒力的苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis （Bt）。本研究通过扫描电子显微镜、大质粒电泳、总蛋白SDS-PAGE及菌株生长特征观察的方式研究了菌株FB特征,克隆得到了基因cry1Ia、cry1Ea、cry1Ab、cry2Ab和vip3Aa全长,依据全基因组测序结果得到了1个cry8基因部分片段,首次在Bt菌株中同时发现基因cry1类和cry8类,这五种基因推导的氨基酸序列与已知基因序列相比,最高相似性分别为99%、98%、99%、100%、99%,而cry8半长基因与已知基因仅为63%。生测结果表明,蛋白Cry1Ia、Cry1Ea和Cry1Ab对小菜蛾幼虫具有较高杀虫活性。 相似文献
2.
苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基因鉴定、克隆及杀虫活性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、cry2Ab和一种新的cry1类基因,SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达,在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalproteins,ICPs)基因,并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段(1.95kb)插入表达载体pET-21b,转化EscherichiacoliRosetta(DE3)菌株,表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性,LC50分别为100.74μg/mL和29.87μg/mL,进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。 相似文献
3.
为获得新的鳞翅目害虫杀虫基因,根据已知cry1I类基因编码区设计简并引物,采用直接克隆法,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BN23-5质粒DNA为模板进行扩增,并对得到的基因进行鉴定和分析。结果表明:克隆得到一个完整的cry1Ie基因,全长2 160 bp,由719个氨基酸组成,该氨基酸序列与已知的4种Cry1Ie蛋白不同,与Cry1Ie2和Cry1Ie3的氨基酸序列同源性最高,为95.4%,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为Cry1Ie5(登录号为KJ710646)。将该基因插入表达载体p ET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导成功表达,SDS-PAGE电泳验证其大小为81 k D,与预测的分子量相符合。生物活性测定表明,Cry1Ie5表达的包涵体蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟具有杀虫活性,LC_(50)分别为0.43μg/m L和48.39μg/m L;对棉铃虫的致死率不高,但能明显抑制其生长;对甜菜夜蛾没有杀虫活性。 相似文献
4.
苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、crygAb和一种新的cry1类基因，SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达，在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs）基因，并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段（1．95kb）插入表达载体pET-21b，转化Escherichia coli Rosetta（DE3）菌株，表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性，LC60分别为100．74μg／mL和29．87μg/mL，进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。 相似文献
5.
在鉴定苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)Btc001菌株cry基因型的基础上，构建了Btc001菌株质粒DNA HindⅢ片段的文库，并利用聚合酶链式反应-限制性酶切片段多态性(PCIR-RFIP)方法筛选出含有crylC6全长基因的13．5kb大片段，酶切分析得到该片段的物理图谱，BamHI和EcoRI切完成了6．5kb含全长基因的亚克隆，并对这条6．5kb片段亚克隆、测序，序列在国际核酸序列数据库(GenBank)登记(AY007686)，并由Bt杀虫晶体蛋白基因国际命名委员会命名为cry1Cb2基因。根据序列设计了一对用于扩增全长基因的引物S581CB和S381CB，扩增产物插入表达载体pET-21b中，诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达。表达产物对小菜蛾(Plutella xylostella)表现出较高活性，LC50达到7．9μg/ml。 相似文献
6.
为了寻找对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因资源,以实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株为材料,通过杀虫活性测定筛选到43株对蛴螬有活性的菌株,其中菌株C9对3种供试昆虫均有活性.光学及扫描电镜检测发现这些菌株均释放球形晶体.SDS-PAGE分析显示这些菌株均表达约130kD的蛋白.采用3种方法分析43株菌株的杀虫晶体蛋白基因类型,结果显示:其中21株只含cry8Ca;13株同时含cry8Ca和cry8Ea基因;QC4等8株菌株只能用引物HRM8F/HRM8R获得高度保守区域约110bp的扩增产物,说明这些基因的5'端序列与已知基因差异较大.测序结果经BLAST分析显示,产物序列同cry8基因的相似性均在98%以上,但其全长基因类型还需要其它方法确定.菌株QCM的PCR-RFLF图谱不同于已发现的cry8基因,推测其中含有新基因. 相似文献
7.
Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera),然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera:Miridae)为害逐年加重,目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料,对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定,研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定,获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株;对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定,LC-MS/MS质谱鉴定结果显示,这些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段,并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明,这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因,推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时,获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株,对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。 相似文献
8.
[目的]从北京植物园采集的土壤样品中分离高毒力的苏云金芽胞杆菌.[方法]采用温度法筛选Bt菌株,比对大质粒DNA图谱,区分不同类型的Bt菌株,PCR-RFLP方法对cry1～cry40类基因型进行鉴定,SDS-PAGE分析杀虫晶体蛋白,测定Bt分离株对大猿叶甲、小菜蛾幼虫的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株.[结果]从149份土壤样品中分离出147株Bt,分为12种类型,含有菱形、方形、球形和不规则等晶体类型;6株菌中分别含有fry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cy1Ah、cry1Ba、cry1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab和cry7Aa等基因类型,其余6株中不含有已知基因.有9株表达约130 ku蛋白,1株表达约70 ku蛋白,2株表达约150 ku蛋白,有3株既表达130 ku蛋白又表达60 ku蛋白;发现一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株ZWY-7,1株对小菜蛾有高毒力的菌株ZWY-9,2株菌都没有检测到已知基因型.[结论]北京植物园中Bt分布广泛,类型多样,其中发现两株高毒力的菌株,有望获得新的杀虫基因. 相似文献
10.
为获得对大黑鳃金龟甲幼虫具有较高杀虫活性的菌株,利用拌土法测定了本实验室分离的500株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)对大黑鳃金龟甲的杀虫活性,建立Bt菌株比较鉴别技术来进行多样性分析,并对菌株的晶体形态及幼虫感染Bt后的中肠组织切片进行观察。结果显示,从500株Bt菌株中筛选到42株对大黑鳃金龟甲幼虫具有不同程度活性的菌株,分属于14个菌株类型;其中有10株校正死亡率大于60%,261-1菌株杀虫活性最高,7 d校正死亡率达100%。从14个菌株类型中各选取1个代表菌株进行基因鉴定,仅P65-1、1126-1、FCD114和78-2菌株分别含有cry8Ma、cry8Ca、cry8Ab、cry8Ga、cry8Ea共5个cry8类新基因,其它10个菌株均不含cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等对鞘翅目害虫有效的杀虫基因。14个菌株中,78-3、127-2和1198-1菌株能产生双锥体型晶体,261-1、FCD114、P65-1、FTL84、78-2和1126-1菌株能产生球形晶体。幼虫感染261-1、1198-1、FCD114、1126-1、QDL40-2菌株后,中肠组织发生明显的病理变化:2 d时肠壁细胞明显出现空洞化,排列疏松,4 d时受到严重破坏并脱离底膜。表明筛选到的Bt菌株具有防治大黑鳃金龟甲幼虫的潜力。 相似文献
11.
禾谷镰孢菌γ-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系分析 总被引：4，自引：0，他引：4
根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL31084(PH-1)的γ-微管蛋白基因核苷酸序列设计5对引物,采用PCR方法从禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)的敏感菌株、室内诱导及田间多菌灵抗药性菌株中分段扩增测序,获得了γ-微管蛋白基因全序列.该基因全长1 868 bp,含有5个内元,编码一含493aa的多肽;与PH-1的γ-微管蛋白基因核苷酸序列同源性99%,存在10个差异核苷酸,与所编码的氨基酸序列同源性100%;与其它7种真菌的γ-微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为31%～72%.中国的2个敏感菌株和4个抗药菌株的γ-微管蛋白基因序列完全相同,认为多菌灵抗药性与该微管蛋白变异无关. 相似文献
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利用Small RNA测序技术对采自湖南的甘薯杆状病毒进行鉴定,获得与SPBV-B序列具有相似性的contigs 161个。首先设计小片段引物,PCR扩增分离出706 bp的目的片段,与SPBV-B (FJ560944)相似性为78%。分段设计引物,进行基因全序列PCR扩增。引物组合SPBV-BF1/R1、SPBV-BF2/R4和SPBV-BF5/R5分别扩增出3 150、2 900和3 500 bp目的条带。序列拼接获得2个SPBV-B基因组全序列,大小分别为7 894 bp(MK052980)和7 981 bp(MK052981),包含完整编码阅读框。进化分析表明MK052980和MK052981与SPPV聚为同一分支,与SPPV相似性分别为81%和83%,与SPBV-B相似性分别为86%和94%。MK052980和MK052981具有89.5%的相似性。经编码阅读框氨基酸序列比对,MK052980序列的ORF3a氨基酸序列存在变异。这是国内首次报道SPBV-B全基因序列。 相似文献
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［目的］ 对四川盆地土壤中Bt资源进行研究,了解其分布特点,为我国苏云金芽胞杆菌的储备奠定基础。［方法］ 从四川盆地5个地区采集土样,分离苏云金芽胞杆菌野生菌株。利用PCR RFLP及SDS PAGE方法对Bt分离株进行基因型鉴定和蛋白分析,并对其室内杀虫活性进行初步测定。［结果］ 从207份土样中获得26株苏云金芽胞杆菌野生菌株,出菌率为12.56%。油镜观察可看到球形、方形、菱形及不规则形的伴胞晶体。在21株Bt分离株中检测到cry1、cry1I、cry2、cry9四类基因,且多数菌株都是同时含有多个基因类型,有5株Bt分离株未发现已知基因;SDS-PAGE显示有9株菌株只表达了130 ku的蛋白, 2株只表达了124 ku的蛋白,2株只表达了45 ku的蛋白,6株同时表达了130 ku和60 ku的蛋白, 4株同时表达了124 ku和60 ku的蛋白, 2株同时表达了135 ku和60 ku的蛋白, 1株同时表达了130、90 ku及75 ku的蛋白。毒力测定结果表明：9株菌株对小菜蛾具有高毒力,2株对大猿叶虫有一定的杀虫活性。［结论］四川盆地土壤中Bt资源多样性丰富,其中有2株有一定的研究前景。 相似文献
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利用Small RNA测序技术对采自湖南的甘薯杆状病毒进行鉴定,获得与SPBV-B序列具有相似性的contigs 161个。首先设计小片段引物,PCR扩增分离出706 bp的目的片段,与SPBV-B (FJ560944)相似性为78%。分段设计引物,进行基因全序列PCR扩增。引物组合SPBV-BF1/R1、SPBV-BF2/R4和SPBV-BF5/R5分别扩增出3 150、2 900和3 500 bp目的条带。序列拼接获得2个SPBV-B基因组全序列,大小分别为7 894 bp(MK052980)和7 981 bp(MK052981),包含完整编码阅读框。进化分析表明MK052980和MK052981与SPPV聚为同一分支,与SPPV相似性分别为81%和83%,与SPBV-B相似性分别为86%和94%。MK052980和MK052981具有89.5%的相似性。经编码阅读框氨基酸序列比对,MK052980序列的ORF3a氨基酸序列存在变异。这是国内首次报道SPBV-B全基因序列。 相似文献
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为了解决目前广泛使用的cry1A类基因的抗性问题,获得对鳞翅目害虫高效杀虫基因,从菌株SC5D2和T03C001中鉴定并克隆到了2个新型cry9Aa基因,被Bt国际命名委员会分别正式命名为cry9Aa3和cry9Aa4,并进一步对其编码的蛋白进行活性测定。结果显示,2个基因对小菜蛾、玉米螟均具有较高的杀虫活性,其中对小菜蛾的LC50分别为1.83μg/mL和1.90μg/mL,对玉米螟的LC50分别为6.93μg/mL和1.06μg/mL。同时,两种Cry9Aa蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾都具有较高的杀虫活性,LC50分别为1.74μg/mL和1.39μg/mL,与敏感小菜蛾杀虫活性测定数据相当,表明Cry9Aa与Cry1Ac没有交互抗性。 相似文献
16.
抗苯并咪唑的小麦赤霉病菌β-tubulin基因序列分析与特性研究 总被引：18，自引：3，他引：15
本研究用真菌U-微管蛋白基因的通用寡聚核苷酸引物B1和B3,扩增并克隆了一段821 bp的小麦赤霉病菌Fusarium graminearum的U-微管蛋白基因片段,并进行了序列测定。根据该序列设计了F.graminearum U-微管蛋白基因的特异性测序引物,测定了赤霉病菌对多菌灵不同抗感菌株的U-微管蛋白基因核苷酸序列,结果表明不同F.graminearum菌株的U-微管蛋白的165,198,200和257位氨基酸未发生突变,在克隆的片段内也未发现核苷酸突变引起的氨基酸改变。表明该菌对多菌灵产生抗性的分子机制与目前已知的其它真菌有所不同,有待进一步研究。 相似文献
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依据对夜蛾科具有高毒力cry基因的序列,设计特异性引物对实验室保存的对鳞翅目害虫高效的菌株资源进行筛选。通过比较质粒图谱,对其多样性进行了研究。进一步测定Bt菌株对甜菜夜蛾的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株。从192株菌株中筛选出15株对夜蛾科害虫具有高活性的菌株,包含的基因类型有:cry1A、cry1C、cry2A、cry9和vip3A类基因,晶体形态包含:双锥体形、方形、球形;其中2株菌表达130ku和60ku的蛋白,1株菌表达130ku和70ku的蛋白,其余菌株均表达约130ku的蛋白;这15株菌通过质粒图谱分析分为8种类型;3株菌对甜菜夜蛾幼虫具有高毒力,其中菌株PS3-C2对甜菜夜蛾LC50为1.87μg/mL。本研究成功筛选出对甜菜夜蛾具有高毒力的菌株3株,其中PS3-C2菌株与对照菌株KN11活性相当,为新型杀虫基因分离克隆与制剂的研发奠定了基础。 相似文献
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《中国生物防治学报》2015,(4)
苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringicnsis(Bt)是一种广泛存在于自然界中的生防微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的内毒素(insecticidal crystal proteins,ICPs)、营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,VIP)和分泌期杀虫蛋白(secreted insecticidal protein,Sip),相比于以上2种杀虫蛋白,Sip的研究相对较少。本研究从实验室中的Bt野生菌株中克隆sip基因,其中编号为DQ89的Bt菌株成功克隆得到1188 bp大小的sip基因,编码395个氨基酸,与已知的Sip1A蛋白的相似性为87%,序列提交到Gen Bank并获得登录号KP114614。将该基因在大肠杆菌中表达的蛋白进行生物活性测定,结果显示其对大猿叶甲Colaphellus bowringi Baly具有一定的杀虫活性,其LC50为1.542μg/m L。 相似文献
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根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL31084(PH-1)的γ-微管蛋白基因核苷酸序列设计5对引物,采用PCR方法从禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)的敏感菌株、室内诱导及田间多菌灵抗药性菌株中分段扩增测序,获得了γ-微管蛋白基因全序列。该基因全长1 868bp,含有5个内元,编码一含493aa的多肽;与PH 1的γ-微管蛋白基因核苷酸序列同源性99%,存在10个差异核苷酸,与所编码的氨基酸序列同源性100%;与其它7种真菌的γ-微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为31%~72%。中国的2个敏感菌株和4个抗药菌株的γ-微管蛋白基因序列完全相同,认为多菌灵抗药性与该微管蛋白变异无关。 相似文献
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根据已报道的14个cry1Ca基因,设计能够扩增cry1Ca全长基因的简并引物。利用该引物对本实验室分离的472株Bt菌株进行筛选。PCR扩增发现22株菌含有cry1Ca基因。对22株菌株进行cry基因多样性分析,结果获得5种类型酶切图谱,表明这些菌株分为5种类型。SDS-PAGE结果显示22株菌均表达约130ku的蛋白。Western Blotting结果证实这些株菌中cry1Ca基因均正常表达。提取菌株的晶体蛋白,经胰蛋白酶活化,对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]进行初步生测,结果表明22株菌中活化的Cry蛋白对甜菜夜蛾均表现出很强的毒杀作用。进一步从5个类型的菌中各挑选一株毒力较高的菌株进行LC_(50)的测定,结果证实它们均具有很高毒力,其中,T1-E12(0.087μg/g)、B16-C8(0.103μg/g)、T1-B8(0.202μg/g)的活性与阳性对照菌株G03(0.090μg/g)相当,具有生产应用潜力。本研究为新型高效Bt菌株的挖掘奠定了基础。 相似文献