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1.
用改良的McCoy's 5a无血清培养液(含20 mmol/LHepes、3 mmol/LL-谷氨酰胺、0.1%BSA、29 ng/mL睾酮、2.5μg/mL转铁蛋白、100ng/mL胰岛素和4ng/mL硒),在96孔培养板中,每孔250μL培养液的条件下,研究了卵泡的入培直径及共培养卵泡数对牛腔前卵泡体外发育的影响.结果表明Ф＞130μm的腔前卵泡成腔率、成活率及发育率高于Ф＜130μm的其它两组(60μm＜Ф＜130μm和Ф＜60μm)腔前卵泡(P＜0.05);每孔1个和每孔2个卵泡培养有利于卵泡的生长和发育,在体外培养15 d时,每孔1个和每孔2个卵泡和卵母细胞直径平均增长值显著高于每孔3个卵泡共培养组(P＜0.01).体外培养10 d后成腔率、发育率和成活率均高于每孔3个卵泡共培养组(P＜0.05).说明在此无血清培养系统中,卵泡的直径越大,在体外培养时成活率越高,生长和成腔越快.同时,共培养卵泡数不能超过3个. 相似文献
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表皮生长因子对卵泡刺激素促进的小鼠胚胎卵巢卵泡发育和雌二醇分泌的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
FSH、EGF是参与卵巢功能调节的重要因素，关于EGF对FSH促进的胚胎卵巢卵泡发育和类固醇激素发生的影响报道甚少。本实验经单个卵巢的总卵泡数、生长卵泡数和5个最大卵母细胞的平均直径为卵泡发育优劣的衡量指标，利用我们早期研究建立的无血清培养体系研究EGF对FSH促进的小鼠胚胎卵巢卵泡发育和分泌雌二醇的作用。结果发现：①EGF＋FSH＋雄烯二酮（A）处理组的胚胎卵巢总卵泡数在培养第7－9d显著高于FSH＋A处理组，而且生长卵泡数和卵巢内5个最大卵母细胞平均直径在培养后期也显著高于FSH＋A处理组（P＜0.05);②FSH＋A处理组的胚胎卵巢在培养第7－9d分泌大量雌二醇，而GF和FSH联合使用时胚胎卵巢的培养早期雌二醇分泌水平显著低于FSH＋A处理组（P＜0.05）。结果提示EGF协同FSH促进小鼠胚胎卵巢卵泡体外生长发育；同时EGF抑制SH诱导的雌二醇分泌，其促卵泡发育作用可能与雌二醇的合成不相关联。 相似文献
3.
本研究采用梳刮的机械法分离水牛胎牛、青年牛和成年牛腔前卵泡,并分别进行培养。每个胎牛、青年牛和成年牛的卵巢分别获得943.43±143.13、249.50±40.11和128.50±19.99个腔前卵泡,从胎牛卵巢获得的腔前卵泡,其数量明显多于青年牛和成年牛(P<0.01)。培养72h后青年牛和成年牛的腔前卵泡存活率分别为52.67%、52.03%,而胎牛仅有34.69%的腔前卵泡能够存活,其数量明显低于青年牛和成年牛(P<0.05)。结果表明,青年牛卵巢分离得到的腔前卵泡数量较多,且培养成活率高,是进行水牛腔前卵泡分离培养等研究的理想试验材料。 相似文献
4.
山羊卵母细胞的显微受精及胚胎培养 总被引：2，自引：0，他引：2
采用胞质内精子注射（ICSI）构建山羊显微受精胚，在两种培养液（CR1aa和SOFaa）与颗粒细胞共培养条件下，分别添加不同浓度的牛卵泡液（BFF）和胎牛血清（FBS），研究其对山羊卵母细胞显微受精胚体外发育的影响。结果表明：①在CR1aa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率最高（22．2％），显著高于添加5％（13．1％）和15％（2．7％）组。②在SOFaa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率（25．1％）显著高于添加5％（12．9％）和15％（3．0％）组。③在两种培养液中，分别添加10％BFF和10％FBS，ICSI胚的囊胚率分别为22．6％和26．9，5．8％和6．1％。表明：CR1aa和SOFaa两种培养液都适宜山羊的1CSI胚体外培养；在早期胚胎培养中，添加10％BFF可显著提高ICSI胚的囊胚发育率：添加10％BFF比添加10％FBS对提高早期胚胎培养质量更为有效。 相似文献
5.
本研究系统探讨了卵泡细胞对牛卵母细胞体外成熟的影响。颗粒细胞及其单层细胞对卵母细胞成熟后的分裂率(分别为85.4%和89.4%,对照为88.5%)及囊胚发育率(分别为35.9%和41.2%,对照为37.1%)无明显影响(P>0.05),然颗粒细胞的条件液则使卵母细胞的分裂率(81.4%,对照为88.5%)明显降低(P<0.05)。加入5×10~6/mL 内膜细胞、内膜细胞的单层细胞或25%条件液到成熟培养系统中,卵母细胞的囊胚发育率均有所提高,分别为44.1%,42.6%及39.8%。进一步探讨应用内膜细胞条件液的几个问题发现:条件液在成熟液中的合适比例为50%,收集的适宜细胞培养阶段为3～4d;条件液制备前应加入10%的血清,不加促性腺激素。这些结果表明:内膜细胞可分泌一些有利于卵母细胞成熟的生长因子。这些生长因子分泌的质和量可能取决于内膜细胞的培养阶段、血清浓度及外源激素的种类。 相似文献
6.
综述了各种动物（鼠、兔、羊、牛、猪、猫和犬）腔前卵泡的研究历史和现状，主要讨论了腔前卵泡的分离方法、体外培养技术和培养液的添加成分等问题。 相似文献
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本研究系统探讨了牛卵泡液（ＢＦＦ）对牛卵母细胞体外成熟的影响。在成熟培养液中添加１０％的ＢＦＦ，明显提高牛卵母细胞体外成熟后的囊胚发育率（４５．１％比２８．２％，Ｐ＜０．０５），虽然该处理对牛卵母细胞体外成熟后的受精分裂率无明显影响（８７．５％比８７．５％）。然而，当ＢＦＦ在成熟培养液中的浓度提高到４０％时，卵母细胞体外成熟后的受精分裂率（６８．６％）和囊胚发育率（１６．６％）均明显下降（Ｐ＜０．０５）。来自不同大小卵泡（２～５ｍｍ，５．１～８ｍｍ和大于８ｍｍ）ＢＦＦ的卵母细胞体外成熟培养效果无明显差异，只是来自大于８ｍｍ卵泡的ＢＦＦ将卵母细胞粘在一起，明显地降低成熟培养后的可用卵母细胞数。在成熟培养液中加入激素（２．５×１０３ｉｕ／Ｌ促性腺激素（ＨＣＧ），５０ｉｕ／Ｌ促乳素，０．０５ｍｇ／Ｌ胰岛素、睾酮和雌二醇）对ＢＦＦ的卵母细胞成熟培养效果无影响。这些结果表明，在成熟培养液中添加一定浓度的ＢＦＦ可促进牛卵母细胞获得胚胎发育能力，ＢＦＦ的这一作用与其来源的卵泡大小和激素的存在与否无关。 相似文献
8.
根据母牛卵巢黄体发育状态将实验用卵巢相应地划分为早期黄体(ELP)、功能黄体(LP)和退化黄体(LLP)三个试验组(实验1);实验2则按实验卵巢上卵泡的表面直径大小划分为小于2mm,2～6mm 和大于6mm 三组.采用注射器抽取法采集卵泡里的卵母细胞,然后按 Lu 等报导的方法进行体外成熟培养和体外受精。受精卵继续在体外条件下培养到囊胚阶段。实验2还进一步观察了囊胚体外发育到孵化囊胚的比率。结果表明,来自不同发情周期阶段的牛卵母细胞,经体外成熟培养后,各组体外受精分裂率(74.3%～78.4%)及体外囊胚发育率(27.7%～31.3%)均无显著差异;而来自表面直径小于2mm 卵泡的卵母细胞,其体外受精分裂率和体外囊胚发育率均显著地低于2～6mm 及大于6mm 组(P<0.01);来自直径大于6mm 卵泡的卵母细胞受精后的早期胚胎体外囊胚发育率均显著高于其余两组(p<0.01)。表明卵泡及其卵母细胞在体内的发育程度对其后体外受精及早期胚胎进一步发育的能力只有一定的影响。 相似文献
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家畜类腔前卵泡的体外分离方法和培养体系研究进展 总被引：2，自引：0，他引：2
摘要： 在哺乳动物体内，启动卵泡生长的机制还不完全清楚，卵泡的体外培养遇到较大困难；由于不同物种卵泡的成熟时间和调节机理有较大差异，因此它们的体外培养技术还不能通用。在过去的几年，不同动物的卵泡体外培养体系的建立均有一定程度的发展，而且对卵泡的发育过程也有了很好地了解，但是获得高质量的成熟卵母细胞还有相当的距离。在目前的技术条件下，啮齿类的腔前卵泡已能经体外培养发育至有腔卵泡期，而且从有腔卵泡分离的卵母细胞经体外成熟、体外受精后已能产生新的个体。但家畜类腔前卵泡的体外培养体系还处于早期研究阶段，探讨早期卵泡的发育特征，建立成功的体外分离方法和培养体系是开发家畜类卵巢资源的基础。 相似文献
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哺乳动物卵泡发育是一个被众多内分泌、旁分泌和自分泌因素精确调控的生理过程。原始卵泡生长启动可能受卵巢内在因子，如生长因子等的调控，而不是通常认为的FSH(促卵泡素)；原始卵泡细胞连接和原始卵泡的细胞(卵母细胞和颗粒细胞)之间相互作用也参与调节原始卵泡的生长启动 相似文献
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奶牛硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)启动子的克隆及活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪酸合成过程中的一个主要限速酶,为了研究奶牛脂肪合成的基因调控机制,本研究首先从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段(分别为212、380、416和760bp),采用生物信息学的方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点,将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切,连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3和pGL3-SCD4。将载体纯化后,瞬时转染到HepG2细胞,对细胞施加胰岛素(10IU/mL)和亚油酸(120μm)处理,通过双荧光素酶报告基因检测启动子荧光素酶相对活性,结果发现,在SCD启动子序列上存在Sterol-regulated element(SRE)转录因子的结合位点,随着SCD启动子片段长度的延长,启动子活性也显著提高,pGL3-SCD4具有最高的启动子活性。与对照组相比,pGL3-SCD1~4启动子的活性在胰岛素刺激下都显著增强(P<0.05),其中pGL3-SCD4的启动子的相对活性最高,达到了46.93。在亚油酸刺激下,pGL3-SCD1~3的启动子活性没有显著变化,而pGL3-SCD4的活性显著减弱(P<0.05),研究表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段(-398~-742)可能对于SCD基因的表达调控具有重要作用。 相似文献
12.
肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉发育的负调控基因,突变后会引起肌肉的过度发育,在肉用动物育种中有非常重要的价值。本研究利用锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)对牛(Bos taurus)MSTN基因的第二外显子特异性剪切,诱导该基因的突变,从而达到敲除该基因的目的。首先对脂质体介导的双质粒共转染牛成纤维细胞的条件进行优化,获得的共转染效率高达19.27%;之后利用两组ZFNs对牛成纤维细胞进行转染,单细胞通过口吸法移入96孔板,经扩大培养后进行PCR筛选,获得18株MSTN基因突变细胞株,其中包括一株双等位基因敲除的细胞系,两组ZFNs对牛成纤维细胞的突变效率分别为6.05%和3.84%;最后,挑选一株突变细胞系进行体细胞核移植研究,共获得24枚重构胚;将去除透明带的重构胚培养于2i培养液中,获得囊胚来源的类滋养层干细胞,通过PCR和测序检测,证明该细胞系在MSTN基因第二外显子具有与供体细胞相同的突变。结果表明,所合成的两组ZFNs可以在MSTN作用位点引起突变,具有很高的突变效率,而且能获得双等位基因突变的细胞株,获得的细胞株能够用作体细胞核移植的供体细胞。本研究为肉用牛的品质改良和育种工作提供了基础资料。 相似文献
13.
以分离新生牛腹股沟白色脂肪组织的前脂肪细胞进行原代培养为基础,采用MTT比色法和油红O提取比色法研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对牛前脂肪细胞增殖及分化的影响,同时通过半定量RT-PCR检测不同浓度EGF处理细胞第8天时对分化标志基因脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid-binding protein,A-FABP)mRNA表达的影响.结果表明,10 ng/mL EGF能极显著地促进前脂肪细胞的增殖(P<0.01),在分化诱导后添加不同浓度的EGF在第8天均可促进脂肪细胞的分化,并能促进脂肪细胞分化标志基因LPL、PPARγ和A-FABPmRNA的表达.EGF可以促进牛前脂肪细胞的增殖和分化. 相似文献
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牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的两条互补的寡核苷酸链,退火后在5’端和3’端分别形成BamHI和XhoI位点的粘性末端。合成的LfcinB基因定向克隆到pET-32a原核表达载体,阳性克隆菌用TB培养基进行扩大培养,然后用终浓度1.0 mmol/L的IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果显示,LfcinB基因在大肠杆菌中获得了大量表达,表达蛋白以包涵体形式存在,利用TGE透析液对纯化的LfcinB重组蛋白包涵体进行了复性,复性的LfcinB重组蛋白的纯度为96.6%。 相似文献
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肌肉卫星细胞是源自中胚层的肌源干细胞,具有增殖分化融合成肌管并形成肌细胞的能力.在体内条件下,肌肉卫星细胞不可能跨胚层分化为内胚层来源的胰腺细胞.本研究从牛(Bos taurus)胎儿肌肉中分离培养得到肌肉卫星细胞,并在体外条件下将其诱导成胰岛素分泌细胞.在诱导过程中,分析了与胰腺发育相关的胰十二指肠同源基因盒1基因(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX1)、神经原素3基因(neurogenin 3,NGN3)、淀粉酶基因(Amylase)和胰岛素基因(Insulin,INS)的动态表达情况.结果表明,PDX1作为决定胰腺分化发育和胰岛功能的主要调节基因,在诱导分化的第2天能够检测到其mRNA的表达,在第3天表达量达到了最大,第4天以后维持在较低水平.NGN3是内分泌细胞形成非常重要的转录因子,是能够将胰岛素分泌到胞外的关键基因,其mRNA在分化诱导的第3天开始表达,第4天达到最高水平,之后逐渐下降.Amylase是胰腺发育中细胞外分泌相关的基因,Amylase mRNA在第6天才开始表达,8d后达到最高.INS mRNA表达量在11～12 d最高,酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)发现,诱导形成的胰腺细胞能够正常分泌胰岛素,培养液中胰岛素的浓度在诱导的11～12 d达到最高值.向培养液中添加葡萄糖后,可使细胞的胰岛素分泌量显著提高,说明诱导得到的细胞类似于成体胰岛的功能,其胰岛素分泌受外界葡萄糖浓度的调节.上述结果表明,肌肉卫星细胞可以被诱导转分化为胰岛素分泌细胞,并对培养环境中的葡萄糖刺激做出应答反应.本研究结果为进一步的研究和临床应用提供基础资料. 相似文献
16.
丙戊酸(valproic acid,VPA)作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,能提高细胞内组蛋白乙酰化水平,影响基因的表达.为探讨VPA对体细胞生长的影响,本实验以牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞为研究对象,利用流式细胞技术探讨VPA处理牛体细胞对其细胞周期的影响,并利用Real-time PCR检测VPA处理后细胞转录因子Oct4、Nanog和Cdx2基因表达变化的影响.结果显示,体细胞经0.8、1.0和2.0mmol/L的VPA分别处理24、48和72 h后,随VPA浓度的增加,体细胞增殖减缓,细胞周期抑制在间期0/间期1 (G0/G1)期.对转录因子Oct4、Nanog和Cdx2基因表达量的检测表明,与未处理组相比VPA处理后细胞Oct4和Nanog的表达量提高,而Cdx2基因的表达量降低.研究结果表明,VPA处理能够改变成纤维细胞的生长特性和基因表达状态,本研究牛体细胞核移植胚胎表观重编程及发育研究提供了参考资料. 相似文献
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为方便性别鉴定方法在现场应用,利用睾丸特异蛋白基因(TSPY)建立了奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法.设计并合成了TSPY雄性特异和雌、雄共有基因引物,并利用已知性别的奶牛血液DNA为模板,初步建立了性别鉴定的PCR反应体系和非电泳的性别鉴定方法.灵敏度试验结果显示,雄性特异引物和共有基因引物对在模板10～60 Pg时,其性别鉴定的准确率为100%,提示TSPY基因具备鉴定胚胎性别的可能;同时采用非电泳法和环介导的等温扩增(LAMP)法鉴定6枚胚胎的性别,两者结果完全一致;用非电泳法检测TSPY基因鉴定了43枚胚胎的性别,对其中鉴定为雌性的21枚胚胎分别移植给自然发情后6～8天的受体,结果9头出生的犊牛均为母牛.结果表明.TSPY基因是一个很好的雄性特异标记,非电泳检测TSPY基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定结果准确可靠. 相似文献
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应用牙釉蛋白(AML)基因鉴别牛早期胚胎性别 总被引：2，自引：1，他引：2
牛牙釉蛋白（AML）基因定位于牛X染色体和Y染色体上的同源区域.实验根据牛X、Y染色体AML基因第五内含子上序列同源性只有45.1%以及X、Y染色体该区段之间存在多处碱基缺失的特点,合成了1对性别特异性引物.该引物经扩增后母牛只得到1条467 bp的来自X染色体的扩增条带,而公牛能得到1条源自X染色体的467bp片段的扩增条带和1条源自Y染色体的341 bp的扩增条带.经基因组DNA验证,该引物的公母鉴定准确率为100%,同时该对引物具有高度的牛特异性.定量分析AML基因引物的反应灵敏度,发现1次PCR（30个循环）能扩增出0.5ng的基因组DNA,2次PCR（共50个循环）能扩增出20pg的基因组DNA.将AML基因引物与SRY基因引物的反应灵敏度相比较,结果表明前者的灵敏度比后者的高8～10倍.用AML基因反应体系鉴定了26枚优质胚胎,其中24枚有扩增结果,13枚鉴定为公牛,11枚鉴定为母牛. 相似文献
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Toll样受体 (toll-like receptors,TLRs)可识别病原体相关分子模式,通过下游信号转导激活免疫细胞,在天然免疫和适应性免疫应答中起着重要的作用,而白细胞介素1受体相关激酶2(interleukin-1 receptor-associated kinase 2,IRAK2)为TLRs信号转导通路下游重要的分子,起着信号转导与调控作用。为了深入研究牛TLRs信号转导通路对牛病原体所致疾病抗性中的主要作用,采用RT-PCR和RACE方法克隆了牛IRAK2基因的cDNA和进行了基因表达谱分析,并对其基因序列和所编码的蛋白质的结构特征进行了生物信息学分析。结果表明,牛IRAK2基因在乳腺、肝、十二指肠、脂肪、子宫、肾、心、肺、胰和卵巢10个组织中有表达,其序列全长为2 148 bp(GenBank登录号为EU528620),包括36 bp的5'非翻译区（1~36）,1 866 bp的CDS区（37~1 902）和246 bp的3'非翻译区（1 903~2 148）,编码622个氨基酸,其分子量为68 628.31 D,等电点为5.3。IRAK2蛋白含有一个DD结构域和一个S_TKc结构域,位于细胞核、细胞质、线粒体和质膜上,通过DD和S_TKc结构域对TLRs的信号转导有着重要的作用。 相似文献
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溶葡球菌酶(Lysostaphin)是一种含锌的单链蛋白酶,能有效地杀灭金黄色葡萄球菌.内溶素(Endolysin)是双链DNA噬菌体所特有,是一类胞壁质水解酶,具有广泛的抗菌效果.内溶素与抗生素之间有高效的协同作用.本研究通过BTX电转染和AMAXA核转染的方法将含有溶葡球菌酶(Lysostaphin)和内溶素(Endolysin)两个目的基因(Seq2和Seq3)及绿色荧光蛋白(enhencedgreenfluorescent protein,EGFP)和新霉素(neomycin,neo)两个标记基因的载体pBC1-seq2+seq3-EGFP-neo,导入牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞,经荧光观察、G418筛选和PCR鉴定后建立稳定转染的单克隆阳性细胞系.以其作为核供体,体细胞核移植制备转基因胚胎.通过4组不同转染程序(A-023,V-013,V-023和T-016)转染牛胎儿成纤维细胞,结果表明,转染参数T-016最适合本实验,其AMAXA转染效率(20.11％)为BTX电转染转染效率的5倍.转基因囊胚率为(20.08±4.19)％,并发育正常.本研究建立了牛胎儿成纤维细胞系,筛选出高效的转染参数,并获得了含溶葡球菌酶、内溶素的转基因细胞系和转基因囊胚,为制备抗乳房炎转基因牛及寻找防治奶牛乳房炎新途径提供了技术支持. 相似文献