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1.
[目的]构建莱茵衣藻2A38的MAPK4基因的RNAi载体。[方法]提取莱茵衣藻细胞总RNA,利用PCR扩增出编码MAPK4的基因片段,用基因工程技术将MAPK4基因片段连接载体p MD18-T上,经过2次不同的双酶切后,与RNAi中间载体p T282连接,最后连接到干涉载体p Maa7IR/XIR上,用酶切及测序鉴定MAPK4基因RNAi载体并转化莱茵衣藻。[结果]经限制性内切酶酶切及测序鉴定,证实为重组质粒,并且该重组载体可在莱茵衣藻中表达。[结论]构建的MAPK4基因RNAi载体结构正确,为进一步利用RNAi技术使MAPK4基因沉默表达,研究MAPK4在莱茵衣藻中的生物学功能奠定了试验基础。 相似文献
2.
基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用Northern杂交检测是否有si RNA产生。结果表明:用Northern杂交可以检测到p23特异的si RNA,在墨西哥莱蒙叶片中瞬时表达的农杆菌ds2301–p23可以发生RNAi,表达有效的si RNA。本研究中构建的骨架载体可以广泛用于RNAi载体的构建,含有柑橘衰退病毒基因片段的3个载体可以用于基因功能分析及具有CTV抗性的柑橘种质资源获得。 相似文献
3.
根据玉米(Zea mays)Zmb ZIP的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pGM-T-ZmbZIP为模板PCR扩增ZmbZIP基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建该基因的植物表达载体.结果表明,扩增出的ZmbZIP基因片段长度为894 bp.经PCR检测及测序鉴定,表明植物表达载体构建成功,为进一步研究该基因的功能奠定了基础. 相似文献
4.
通过构建无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体,为研究ACS基因的功能及采用生物技术方法培育无花果耐贮新品种奠定基础。本试验根据已克隆的无花果ACS1基因序列及植物表达载体pBI221、pBI121的酶切位点,设计2对带相应酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,进行PCR扩增,获得正、反向扩增片段,分别正、反向插入到pBI221载体中的CaMV35S启动子和gusA基因之间,构建成无花果ACS1基因的RNAi中间表达载体。再将中间载体中的正、反向片段和gusA基因以双酶切方式连接到表达载体pBI121上,构建成pBI121-RNAi-ACS1植物表达载体。通过各种限制性内切酶的酶切鉴定,成功构建了无花果ACS1基因的RNA干扰植物表达载体。 相似文献
5.
一种用于植物基因沉默的新RNAi载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
《沈阳农业大学学报》2017,(6)
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法。为解决目前植物RNAi载体构建繁琐复杂的问题,本研究以常用的植物过量表达载体pRI 101-AN为基础,在其多克隆位点处插入源自pKANNIBAL载体的内含子序列,获得pRNAi-E载体。在此基础上,只要将目的基因特异序列的正反向片段分别连接到内含子两侧,即可构建目的基因的RNAi载体。为了验证pRNAi-E载体的效果,苹果IAA29(Md IAA29)基因的正向和反向片段被插入到pRNAi-E载体上,获得了Md IAA29基因的RNAi载体pRNAi-IAA29。通过农杆菌介导的遗传转化,获得了GL-3苹果的转基因株系。qRT-PCR数据显示转基因苹果植株中IAA29的转录水平比非转基因对照显著下调,表明基于pRNAi-E构建的RNAi载体能够有效地沉默苹果内源基因的表达。本研究构建的pRNAi-E载体使得植物基因RNAi载体构建变得简单高效,对于开展植物基因功能验证研究具有一定意义。 相似文献
6.
根据拟南芥RS基因的编码序列设计引物,利用PCR技术从pGADT7-RS重组质粒上扩增到RS基因编码区476 bp片段。利用双链RNA介导的基因沉默技术,构建RS基因沉默表达载体,为进一步研究该基因在植物与蛋白激发子HpaGXoo互作中的功能及其作用机制奠定基础。首先将RS基因片段连接到pUCm-T载体上,用Pst I/BamH I和Pst I/Xho I分别对pUCm-RS重组载体进行酶切,得到2个RS基因片段;先后将其连接到用相应限制酶酶切的pBSSK-in载体上,构建成pBSSK-RS-in-RS重组载体,该重组载体中的2个RS片段大小一致,反向重复;最后用Sac I/Kpn I酶切pBSSK-RS-in-RS载体得到RS-intron-RS片段,连入表达载体pCAMBIA1301中,构建成该基因的沉默表达载体。 相似文献
7.
Metallothionein基因位于文库克隆载体pTriplEx2上,活化菌液并用限制性内切酶SfiI酶切,同时酶切添加了SfiI酶切位点的环状pMD-18TM,回收目的片段和载体并连接,经过酶切和PCR验证,成功构建克隆载体;再用XbaI和SmaI分别双酶切克隆载体和表达载体pc2301,回收目的片段和表达载体并连接,经酶切和PCR验证,成功构建含有目的基因的表达载体,进而转化植物获得耐重金属的植物株系。初步验证转化后的植株具有抗击重金属的能力。 相似文献
8.
《山东农业科学》2017,(1)
为了构建对啤酒花潜隐病毒(Hp LV)和啤酒花潜隐类病毒(HpLVd)有抗性的RNAi载体,本研究通过序列比对选取Hp LV外壳蛋白基因致病区202 bp和HpLVd 155 bp的保守序列作为干扰序列,以干扰载体p UCCRNAi为基础,成功构建出针对Hp LV和HpLVd的双价RNAi载体,通过特异性酶切位点将构建成功的RNAi载体的功能区域连接在植物表达载体p CAMBIA2300-35S-OCS上,并利用农杆菌介导法将目的基因导入啤酒花中。经PCR鉴定证明RNAi载体已成功转入啤酒花中。本研究基于RNAi技术的植物表达载体构建和农杆菌介导的遗传转化,为诱导转基因植物的转录后基因沉默、获得抗多种病毒病的植物新材料提供参考。 相似文献
9.
[目的]构建蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体.[方法]以英格尔蟠桃为材料,将CTAB改良法提取的蟠桃总RNA反转录成cDNA作为模板,通过RT - PCR扩增约347 bp的保守片段,将目标片段插入到pSK - int中间表达载体中,获得pSK - PLD - RNAi中间表达载体,然后将其转入植物双元表达载体pCAMBI1301中,构建该基因的shRNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi.[结果]经限制性内切酶酶切和测序鉴定证明蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi已构建成功.[结论]蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体的构建为进一步通过RNAi技术延长蟠桃果实的贮藏寿命奠定了基础. 相似文献
10.
[目的]克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础.[方法]根据已报道的HEV2.1序列(GenBank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定.[结果]用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%.将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA230 1-PHEV2.1-HbHMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功.[结论]将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现PstⅠ突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR. 相似文献